Authors:	Bachtadse, Nicholas
Title:	Epigenetische Einflüsse auf die Geschlechtsdetermination von Chironomus thummi und Chironomus piger sowie funktionelle Analyse von Genen aus der geschlechtsbestimmenden Region
Online publication date:	19-Jun-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	Das Geschlecht von Chironomus wird über einen dominanten männchenbestimmenden Faktor M determiniert. Die geschlechtsbestimmende Region, welche den Faktor M enthalten sollte, konnte in C. thummi und C. piger auf Chromosom 3 Arm F lokalisiert werden. In C. thummi ist der Faktor M eng mit einem Cluster tandem-repetitiver Elemente (Cla-Elemente) assoziiert. Da es sich hier um ein frühes Stadium der Evolution von ehemals homomorphen zu heteromorphen Geschlechtschromosomen handelt, wird das Chromosom, das den Faktor M trägt, auch als Proto-Y-Chromosom bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst analysiert, ob die Arten C. thummi und C. piger DNA- und bzw. oder Histon-Methylierungen aufweisen. Dabei konnte gezeigt werden, dass DNA-Methylierungen zumindest in basalen Mengen in beiden Arten vorkommen. Weiterhin wurden die Genome auf das Vorhandensein entsprechender DNA-Methyltransferasen (DNMT) geprüft. Hier konnte gezeigt werden, dass Chironomus ein transkribiertes dnmt2-Homolog besitzt. Sequenzhomologe zu den Methyltransferasen DNMT1 und DNMT3, welche üblicherweise für die Etablierung sowie für den Erhalt funktionaler DNA-Methylierung zuständig sind, konnten jedoch nicht nachgewiesen werden. Diese Befunde decken sich mit Erkenntnissen aus der Literatur, wonach auch die Genome anderer Dipterenarten zumindest in geringem Maße methyliert sind. Die dabei untersuchten Arten besitzen ebenfalls lediglich ein dnmt2-Homolog. Eventuelle geschlechtsgekoppelte DNA-Methylierungsmuster konnten vorliegend ebenso wenig nachgewiesen werden wie das Vorhandensein von Histon-Methylierungen in Form von H3K9. Es gibt demnach keine Hinweise darauf, dass epigenetische Einflüsse bei der Geschlechtsdetermination von Chironomus eine Rolle spielen. Gene aus der SDR, die als Kandidatengene für M in Frage kommen, wie die Gene fs1(K10)-like und luc7(p)-like, sollten mit Hilfe von RNA-Interferenz funktionell analysiert werden. Dazu konnten zunächst die beiden Gene hunchback und orthodenticle/ocelliless erfolgreich als Positivkontrollen für die RNAi- Versuchsreihen verwendet werden. Die Injektionen von dsRNA gegen fs1(K10)-like oder luc7(p)-like hatten jedoch keine phänotypisch erkennbaren Veränderungen bei den behandelten Chironomiden zur Folge. Weiterhin sollte die Sequenz des bestehenden Proto-Y-Chromosoms der SDR von C. thummi erweitert werden. Hierzu wurden zunächst C. thummi-Männchen mit C. piger-Weibchen verkreuzt. Das Genom eines Individuums aus diesem Kreuzungsstamm konnte mittels Hochdurchsatz-Technologien sequenziert werden. Die daraus erhaltenen Sequenzinformationen konnten nur teilweise dazu verwendet werden, den bestehenden Proto-Y-Contig zu erweitern. So war eine Verlängerung in distaler Richtung (Richtung Telomer) nicht möglich. Grund hierfür sind „geclustert“ vorliegende Cla-Elemente, die über eine Länge von ca. 20 kb in der Y-Chromosomen-spezifischen SDR von C. thummi auftreten. In Richtung des Zentromers konnte der Proto-Y-Chromosomen-spezifische SDR-Contig hingegen um ca. 3,5 kb verlängert werden. Der dadurch neu erhaltene Sequenzabschnitt enthält eine Y-Variante des Gens wd74-like sowie das 3‘-Ende des Gens luc7(p)-like. Es konnten jedoch bisher keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede in dem neuen Sequenzabschnitt gefunden werden. The sex of Chironomus sp. is determined by a dominant male-determining factor M. The sex-determining region, which should contain factor M, could be located in C. thummi and C. piger on chromosome 3 arm F. In C. thummi, factor M is closely associated with a cluster of tandem repeats (Cla elements). Because of the early stage of evolution of once homomorphic sex chromosomes towards heteromorphic sex chromosomes, the factor M bearing chromosome is also referred to as proto Y chromosome. In this study, presence of DNA methylations and/or histone methylations was analyzed in C. thummi and C. piger. DNA methylations were detected in both species, at least in basal quantities. Furthermore, the genomes were tested for the presence of corresponding DNA methyltransferases (DNMT). It could be shown that Chironomus has a transcribed dnmt2 homologue. Sequence homologues to the methyltransferases DNMT1 and DNMT3, which are usually responsible for the establishment and maintenance of functional DNA methylation, could not be detected. These results are consistent with findings from the literature, according to which the genomes of other Diptera species are methylated at least to some small extent. There, all species show only one dnmt2 homolog as well. Possible sex-linked DNA methylation patterns were not detected in the present case, as goes for the presence of histone methylations in the form of H3K9. Therefore, no evidence was found that epigenetic influences play a role in the sex determination of Chironomus. Further, candidate genes for M from the SDR, such as the genes fs1(K10)-like and luc7(p)-like, were functionally analyzed using RNA interference. First, the two genes hunchback and orthodenticle/ocelliless were successfully established as positive controls for RNAi. However, injections of dsRNA against fs1(K10)-like or luc7(p)-like did not result in phenotypic changes in the treated chironomids. Another goal of this study was the extension the existing proto-Y chromosome sequence of the SDR of C. thummi. For this purpose, C. thummi males were crossed with C. piger females in a first step. The genome of an individual from this crossbred strain could be sequenced using high throughput technologies. The resulting sequence information could partially be used to extend the existing proto-Y contig. Thus, an extension in the distal direction (towards the telomere) was not possible. This is due "clustered" Cla elements that occur over a length of about 20 kb in the Y-chromosome-specific SDR of C. thummi. In the direction of the centromere, however, the proto-Y chromosome-specific SDR contig could be extended by about 3.5 kb. The newly obtained sequence section contains an Y variant of the gene wd74-like and the 3' end of the gene luc7(p)-like. However, no significant gender-specific differences in the new sequence section have been found so far.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4446
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000020520
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	IV, 109, A 24 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen