Authors:	Beck, Simone
Title:	Von funktionalen polymerbasierten Transfektionsagenzien und enzymatischen Antikörpermodifizierungen zur bioorthogonalen Konjugation
Online publication date:	14-Jun-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	Within the research area of nanoparticle-based tumor immune therapy, the de-velopment of polymer-based transfection vectors for efficient delivery of nucleic acids offers great potential in anti-tumor vaccination. It seems very promising to activate the body’s own immune system with pDNA or mRNA vaccines to combat malignant cells of solid tumors or even metastasis. Therefore, a main topic in this thesis was the further development of poly-(L-lysine)-block-poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylate) block copolymers as transfection vectors for dendritic immune cells. The combination of ring-opening polymerization of N-E-(Boc)-L-lysine N-carboxyanhydride and RAFT polymerization (reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization) of pentafluorophenyl methacrylate enabled the syn-thesis of p(Lys)-b-p(PFPMA) reactive ester precursor block copolymers. After several post-polymerization modification steps, multifunctional p(Lys)-b-p(HPMA) block copolymers were obtained. The complexation of negatively charged nucleic acids, such as pDNA or mRNA, was achieved by electrostatic interactions with the cationic poly(L-lysine) block. The most important advantage of using poly(HPMA) as suitable shielding block for the charged polyplex is the straightforward synthesis via the reactive ester approach. Besides the conversion with 2-hydroxypropylamine the introduction of many different functionalities like fluorescent dyes by sequential aminolysis of the poly(PFPMA) block shows great benefit. In order to enhance transfec-tion efficiencies, the incorporation of an acid-labile hydrazone moiety within the p(Lys)-b-p(HPMA) block copolymer was evaluated. The hydrolytic cleavage of the hydrazone in the acidic endosomal compartments should facilitate the polyplex’ endosomal escape and consequently contribute to improved transfection efficien-cies. Furthermore, the poly(L-lysine) block of p(Lys)-b-p(HPMA) block copolymers was statistically modified with thiol-reactive 2-(pyridyldithio)-propionate moieties for reversible core cross-linking. In general, a disulfide cross-linking is known to improve the extracellular stability of the polyplex and in this work it was used for the additional incorporation of endosomolytic LAH4-L1 peptide as dithiol cross-linker. With regard to a cell type-specific uptake of p(Lys)-b-p(HPMA)-based nanovac-cines by dendritic immune cells, the attachment of DEC205 antibodies as targeting ligands onto the polyplex’ surface was investigated. For this purpose, strain-promoted alkyne-azide-cycloaddition was used as bioorthogonal conjugation strategy. The synthesis of two azide-functionalized block copolymers was per-formed by post-polymerization modification. The resulting p(Lys)-b-p(HPMA)-N3(stat) and p(Lys)-b-p(HPMA)-N3(end) differ in number and position of azide moieties and were both employed for polyplex formation. DBCO-functionalization of aDEC205 was conducted by a two-step enzymatic antibody modification approach, using bacterial transglutaminase (BTG). This enzymatic strategy enables the site-specific modification at two distinct glutamine side chains within the IgG antibody and was applied for different BTG-substrates in bioorthogonal antibody conjugations. Die Entwicklung polymerer Transfektionsvektoren für den Transport von Nukle-insäuren zeigt großes Potential im Bereich der Nanopartikel-basierten Tu-morimmuntherapie. Dabei stellt die Bekämpfung maligner Zellen solider Tumore, aber auch von metastasierenden Tumorzellen über die Aktivierung des Immunsys-tems mit pDNA- bzw. mRNA-Vakzinen einen vielversprechenden Ansatz dar. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der chemischen Modifizierung von Poly-L-lysin-block-Poly(N-(2-hydroxy-propyl)methacrylat) Blockcopolymeren als Transfektions-agenzien für dendritische Immunzellen (DCs). Über die Kombination von ringöff-nender Polymerisation von N-E-(Boc)-L-Lysin N-carboxyanhydrid und RAFT-Polymerisation (reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization) des Reaktivestermonomers Pentafluorphenylmethacrylat konnten P(Lys)-b-P(PFPMA) Vorläufer-Blockcopolymere erfolgreich hergestellt werden. Die Umsetzung zu multi-funktionalen P(Lys)-b-P(HPMA) Blockcopolymeren erfolgte über verschiedene polymeranaloge Reaktionen. Der kationische Poly-L-lysin-Block ist über elektrostatische Wechselwirkungen zur Komplexierung von negativ geladenen Nukleinsäuren befähigt. Der Vorteil in der Verwendung von P(HPMA) als hydrophile Hülle zur Ab-schirmung der Polyplexe liegt in der Darstellung über den Reaktivesteransatz begründet. In einem einzigen Reaktionsschritt können mittels sequentieller Aminolyse des P(PFPMA)-Blocks unterschiedliche Funktionalitäten, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe in die P(HPMA)-Einheit eingeführt werden. In dieser Arbeit wurde der Einbau eines säurelabilen Hydrazonlinkers innerhalb des P(Lys)-b-P(HPMA) Blockcopolymers evaluiert. Die Hydrolyse des Hydrazons im sau-ren Endosomenmilieu soll die endosomale Freisetzung der Polyplexe unterstützen und in Folge dessen die Transfektionseffizienz der Systeme erhöhen. Für eine reversible Kernvernetzung wurde der Poly-L-lysin-Block in P(Lys)-b-P(HPMA) statistisch mit thiolreaktiven 2-(Pyridyldithio)-propionat-Gruppen modifiziert. Im Allgemeinen soll die Disulfidvernetzung zu einer verbesserten extrazellulären Stabilität der Po-lyplexe beitragen und wurde hier für die Einführung des endosomolytisch-aktiven LAH4-L1-Peptids als Dithiol-Vernetzer genutzt. Für eine spezifische DC-Adressierung wurde die Konjugation von DBCO-modifizierten DEC205-Antikörpern als Zielstrukturen auf der Oberfläche von azidfunktionalisierten P(Lys)-b-P(HPMA)-basierten Polyplexen über ringgespannte Alkin-Azid-Cycloaddition umfassend untersucht. Dafür wurden zwei unterschiedliche Blockcopolymere synthetisiert: P(Lys)-b-P(HPMA)-N3(stat) und P(Lys)-b-P(HPMA)-N3(end), die sich in Anzahl und Position der Azidgruppen unterscheiden. Die DBCO-Funktionalisierung von aDEC205 erfolgte über einen enzymatischen Modifizierungsprozess, der die regioselektive Einführung funktionaler Gruppen an zwei spezifischen Glutaminresten innerhalb des Anti-körpers erlaubt. Somit stellt die über bakterielle Transglutaminase-vermittelte enzymatische Antikörperfunktionalisierung mit unterschiedlichen Substraten für bioorthogonale Konjugationen und deren ausführliche Charakterisierung einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit dar.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4442
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000020400
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	198 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen