Authors:	Klein, Raphael
Title:	Screening and structure-based design of novel ligands for FabF and KPC-2 : first steps to counteract an antibiotic crisis
Online publication date:	13-Jun-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	The number of infections with multidrug resitant bacteria is constantly increasing and thus, the need for new antibiotics is becoming more urgent. The World Health Organisation (WHO) recently published a list of 12 bacteria for which there is a critical, high or medium need for new antibiotics. In particular, Gram-negative bacteria like Pseudomonas aeruginosa are associated with a broad spectrum of infections. Attractive targets for drug design are the enzymes involved in cell membrane and wall synthesis. In this thesis, the elongation condensing enzyme FabF of the fatty acid synthesis pathway was chosen as target for further studies. Fatty acids are essential for the formation of the inner and outer cellmembrane of Gramnegative bacteria. Using virtual screening, 2 compounds sharing a thiazolidine- 4-carboxylic acid scaffold binding non-covalently to FabF were identified. Binding affinities of 278 uM and 321 uM were determined using biolayer interferometry. In addition, 1 compound binding covalently was identified using MALDI mass spectrometry. Further investigations of the active site regarding the binding mode of the natural product inhibitor platensimycin were carried out by introducing the point mutation for T271A using site directed mutagenesis and solving the structure of FabF T271A. A fragment library of 651 compounds was screened using biolayer interferometry (BLI). Due to a limited amount of publications using BLI in fragment screens, this gave new insights in the assessment of fragment binding profiles and responses. The false-positive rate was lowered by screening with FabF wild type with a closed binding site and FabF C164Q with an open binding site. Finally, 16 FabF C164Q specific hits were identified (hit rate: 2.5%) out of 67 hits found in the primary screening (10.3%). Another approach of targeting the cell wall synthesis of bacteria is the inhibition of the glycopeptide transpeptidase by beta-lactame antibiotics. However, this approach is limited due to the defence mechanism of bacteria, the production of beta-lactamases, which can inactivate beta-lactame antibiotics through hydrolysis. The carbapenemase KPC-2 was chosen as target enzyme for further studies. Using virtual screening, 10 ligands of KPC-2 were identified, the most potent with a KI of 30 uM. In attempts to improve the binding affinity of this hit compound an amide linker was replaced by a sulfonamide in order to change the geometry of the ligand and to vary the attached group. This substitution targeted the side chains corresponding to amino acids Asn 132, Asn 170 and Leu 166. Finally, it was shown that the sulfonamide linker is not suitable for improving the binding affinity. Die Zahl mutiresitenter Bakterien ist stetig steigend und verstärkt somit die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Antibiotika. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) veröffentlichte kürzlich eine Liste von 12 Bakterien für die die Entwicklung neuer Antibiotika besondere, hohe oder mittelfristige Priorität haben. Vor allem gramnegative Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa sind für ein breites Spektrum von Infektionen verantwortlich. Vielversprechende Angriffspunkte für rationalesWirkstoffdesign sind die für die Zellwandsynthese verantwortlichen Enzyme. In dieser Arbeit wurde das Enzym FabF, welches Bestandteil des Fettsäuresynthesezyklus von Bakterien ist, als Zielprotein für weiterführende Studien ausgewählt. Zum besseren Verständnis der Bindetasche wurde der Bindungsmodus des Inhibitors Platensimycin untersuchts. Dazu wurde die Punktmutation T271A mittels Mutagenese eingefügt und die Struktur von FabF T271A gelöst. Mittels virtuellem screening wurden zwei Verbindungen, die ein gemeinsames Thiazolidin-4-Carboxylat Grundgerüst teilen als Liganden von FabF identifiziert (KD= 278 und 321 uM). Außerdem wurde eine Verbindung mit kovalentem Bindungsmodus durch eine Acrylamidfunktion mittels MALDI Massenspektrometrie identifiziert. Eine Fragment Bibliothek, bestehend aus 651 Verbindungen wurde mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI) gescreent. Die Erkenntnisse über das Bindundsprofil von Fragmenten ergänzen die bisher wenigen Publikationen bezüglich BLI zur Messung von Protein-Fragment Interaktionen. Das Screening wurde parallel mit der Variante FabF C164Q, mit einer offenen Bindetasche und demWildyp, mit geschlossener Bindetasche, durchgeführt. Dadurch konnte die falsch positiv rate gesenkt werden. Letztlich wurden 16 Fragmente ( Trefferrate 2.5%) aus 67 Treffern des primären Screenings (Trefferrate: 10.3%) als FabF C164Q spezifisch indentifiziert. Ein anderer Ansatz die Zellwandsynthese von Bakterien anzugreifen ist die Inhibierung von Glycopeptid-Transpeptidasen durch beta-Lactam Antibiotika. Dieser Ansatz ist durch den Verteidigungsmechanismus von Bakterien, der Expression von beta-Lactamasen, eingeschränkt. Die Carbapenemase KPC-2 wurde als Zielprotein für weiter Studien ausgewählt. Mittels virtuellem Screening konnten 10 Liganden der KPC-2 identifiziert werden, wobei der aussichtsreichste Ligand eine Inhibitionskonstante von 30 uM hatte. Zwecks Optimierung der Bindungsaffinität wurde der Amid-linker durch ein Sulfonamid ersetzt um die Geometrie des Liganden zu ändern un die angehängte Gruppe zu variieren. Diese Änderungen ermöglichen weitere Wasserstoffbrückenbindungen. Letztenendes führte die Variation des Linkers nicht zu einer Verbesserung der Bindungsaffinität.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4440
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000020376
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	IV, 129 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen