Authors:	Wehler, Thomas
Title:	Structure-based design for the discovery of novel ligands targeting the FMN riboswitch
Online publication date:	12-Jun-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	Abstract: The FMN riboswitch is found in the 5'-UTR of bacterial mRNA and regulates gene expression of proteins involved in transport and biosynthesis of riboflavin via feedback control. This RNA structure is widespread among pathogenic bacteria and the ligand binding site is highly conserved among different species. Therefore, the FMN riboswitch represents a suitable drug target for novel antibacterial compounds. For the identification of ligands with novel chemical scaffolds distinct from the chemical constitution of the cognate ligand FMN and its close analogues with known binding properties two successive virtual screening approaches were performed. Subsequently, an unbiased virtual screening with an in-house database of commercially available compounds and a privileged substructure search to facilitate mimicking the most important interactions between the target RNA and its cognate ligand were carried out. The virtual screening hits were tested experimentally to confirm the in silico predictions. Three different methods were applied in order to determine the binding affinities of hit compounds. Whereas a method based on fluorescence quenching and ITC measurements indirectly determined the binding constants of the possible ligands, a SPR method was developed to directly sense the interactions between the FMN riboswitch RNA and possible small molecule ligands. One compound identified by the virtual screening methods was confirmed to bind experimentally. Close analogues of the hit substance are currently under investigation to initialize a small SAR study. Zusammenfassung: Der FMN Riboswitch ist eine RNA-Struktur, welche sich in der 5'-UTR bakterieller mRNA befindet und die Genexpression verschiedener Proteine, die am Transport und der Biosynthese von Riboflavin beteiligt sind, im Sinne eines Feedback-Mechanismus reguliert. Diese spezialisierte RNA-Struktur findet sich in vielen pathogenen Bakterien wieder und die Ligandenbindestelle ist hochkonserviert in den verschiedenen bakteriellen Spezies. Daher eignet sich der FMN Riboswitch als Zielstruktur für neue antibakterielle Substanzen. Für die Identifizierung von Liganden mit Strukturelementen, die sich von denen unterscheiden, die der natürliche Ligand FMN und eng verwandte Flavin-Analoga innehaben, wurden zwei aufeinanderfolgende virtuelle Screening-Methoden durchgeführt. Zunächst wurde die Eignung des Docking-Setups mit Hilfe eines Trainingssets von Verbindungen mit flavinähnlichen Strukturen durch Vergleich der vorhergesagten Bindemodi mit den kristallographisch ermittelten Strukturen validiert. Anschließend wurde einmal ein molekulares Docking mit der gesamten virtuellen Datenbank aus käuflich erwerbbaren Molekülen durchgeführt, gefolgt von einer Begrenzung der Suche auf Substanzen mit privilegierten Substrukturen, die Interaktionen zwischen FMN und RNA einfacher imitieren können. Die Treffer des virtuellen Screenings wurden experimentell getestet, um die in silico vorhergesagte Bindungsaffinität zu bestätigen. Dabei wurden drei verschiedene Methoden angewendet, um die Bindungsaffinitäten dieser Moleküle zu bestimmen. Wohingegegen mit einer auf Fluoreszenzlöschung basierende Methode und ITC-Messungen die Bindungskonstanten der potentiellen Liganden auf eine indirekte Art und Weise bestimmt wurden, wurde eine SPR-basierte Methode entwickelt, um die Interaktionen zwischen dem FMN Riboswitch und den potentiellen Liganden direkt zu bestimmen. Für eine Verbindung, die aus dem virtuellen Screening kam, wurde eine Bindung zum FMN Riboswitch experimentell bestätigt. Aktuell werden strukturell eng verwandte Analoga dieser Substanz untersucht, um Struktur-Wirkungsbeziehungen herzuleiten.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4439
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000020368
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIII, 196 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen