Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4425
Authors: Kellner, Vanessa
Title: Understanding the function of the Rtt101 E3 ubiquitin ligase in response to replication stress
Online publication date: 23-May-2018
Language: english
Abstract: The duplication of the cellular genetic material has to be precisely regulated to maintain genome integrity. Damage caused by a wide range of exogenous factors, commonly summarized as replication stress, interferes with DNA replication. Genome integrity is further threatened by endogenously arising structures such as ribonucleotide monophosphates (rNMP) that are frequently misincorporated into genomic DNA. They are removed by the RNase H2 enzyme in a process termed ribonucleotide excision repair (RER). When RER is defective, rNMPs accumulate in the genome and induce replication stress. Cullin 4 (CUL4)-based E3 ubiquitin ligases are required for DNA replication and repair in the presence of replicative DNA damage. In Saccharomyces cerevisiae, the CUL4 ortholog Rtt101 promotes DNA replication through damaged templates. However, the underlying mechanism and relevant ubiquitylation targets are poorly understood. In this thesis we characterized the mechanism by which Rtt101 promotes DNA replication in the presence of the alkylating drug methyl methanesulfonate (MMS). We found that Rtt101, in complex with the putative substrate adaptor Mms22 (Rtt101-Mms22), counteracts a replicative function of the replisome component Mrc1. However, this does not alter Mrc1 protein levels. Instead, our genetic data suggests that interactions of Mrc1 with other replisome proteins are modulated. We propose that Rtt101 allows recombination-mediated fork restart at MMS-induced DNA lesions. We further uncovered a novel role of Rtt101-Mms22 in the tolerance of misincorporated rNMPs that accumulate in the absence of RER. Cells lacking both Rtt101 and RER display reduced viability, which is not caused by increased levels of genomic rNMPs and can be partially offset by deletion of MRC1. Ubiquitin remnant profiling, a mass spectrometry-based approach, identified the leading strand polymerase ε subunit Dpb2 as a potential target of Rtt101. We suggest that Rtt101 ubiquitylates Dpb2 at replication forks that stall or break due to unrepaired rNMPs. This Rtt101-dependent ubiquitylation might facilitate replication fork restart or DNA synthesis repriming downstream of the site of damage. We present evidence that underlines an important function of the Rtt101 E3 ubiquitin ligase to tolerate several aspects of faulty RER. Our data indicates a similar mechanism as under genotoxin-induced replication stress.
Die Duplizierung des zellulären genetischen Materials muss genau reguliert werden, um die Integrität des Genoms aufrechtzuerhalten. Schäden, die durch eine Vielzahl von exogenen Faktoren verursacht und üblicherweise als Replikationsstress zusammengefasst werden, können die DNA-Replikation beeinträchtigen. Die Integrität des Genoms wird weiterhin durch endogen auftretende Strukturen wie Ribonukleotidmonophosphate (rNMP) bedroht, die häufig in genomische DNA eingebaut werden. Sie werden durch das Enzym RNase H2 in einem als Ribonukleotid-Exzisionsreparatur (RER) bezeichneten Prozess entfernt. Wenn RER defekt ist, akkumulieren rNMPs im Genom und induzieren Replikationsstress. Cullin 4 (CUL4) -basierte E3-Ubiquitin-Ligasen sind für die DNA-Replikation und -Reparatur in Gegenwart von replikativen DNA-Schäden erforderlich. In Saccharomyces cerevisiae fördert das CUL4-Ortholog Rtt101 die DNA-Replikation durch beschädigte DNA Matrizen. Der zugrundeliegende Mechanismus und die relevanten Ziele der Ubiquitylierung sind jedoch kaum erforscht. In dieser Dissertation haben wir den Mechanismus charakterisiert, durch den Rtt101 die DNA-Replikation in Gegenwart des alkylierenden Chemotherapeutikums Methylmethansulfonat (MMS) fördert. Wir haben herausgefunden, dass Rtt101 im Komplex mit dem mutmaßlichen Substratadapter Mms22 (Rtt101-Mms22) einer replikativen Funktion des Replisombestandteils Mrc1 entgegenwirkt. Dies ändert jedoch nicht die Mengen an Mrc1-Protein. Stattdessen legen unsere genetischen Daten nahe, dass Wechselwirkungen zwischen Mrc1 und anderen Replisomproteinen moduliert werden. Wir schlagen vor, dass Rtt101 einen Rekombinations-vermittelten Neustart der Replikationsgabel an MMS-induzierten DNA-Läsionen ermöglicht. Wir haben außerdem eine neue Rolle von Rtt101-Mms22 in der Toleranz von fälschlicherweise eingebauten rNMPs aufgedeckt, die sich in Abwesenheit von RER anhäufen. Zellen, in welchen sowohl Rtt101 als auch RER fehlt, zeigen eine verminderte Lebensfähigkeit, die nicht durch erhöhte Mengen an genomischen rNMPs verursacht wird und durch die Deletion von MRC1 teilweise ausgeglichen werden kann. Mithilfe der Profilerstellung von Ubiquitinresten, einem auf Massenspektrometrie basierenden Ansatz, haben wir Dpb2, eine Untereinheit von DNA-Polymerase ε am kontinuierlich replizierten Strang, als potentielles Ziel von Rtt101 identifiziert. Wir schlagen vor, dass Rtt101 Dpb2 an Replikationsgabeln ubiquityliert, die aufgrund von nicht reparierten rNMPs ins Stocken geraten oder gebrochen sind. Diese Rtt101-abhängige Ubiquitylierung könnte den Neustart der Replikationsgabel oder die Wiederaufnahme der DNA-Synthese hinter der Schadensstelle erleichtern. Wir präsentieren Beweise, die eine wichtige Funktion der Rtt101 E3-Ubiquitin-Ligase unterstreichen, die benötigt wird um verschiedene Aspekte fehlerhafter RER zu tolerieren. Unsere Daten weisen auf einen ähnlichen Mechanismus wie unter Genotoxin-induziertem Replikationsstress hin.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: Externe Einrichtungen
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4425
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: VI, 169 Seiten
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