Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4399
Authors: Blötz, Andrea
Title: HLA class II mismatch alleles as targets of the alloreactive CD4 T-cell response
Online publication date: 27-Feb-2013
Language: english
Abstract: In allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), alloreactive T lymphocytes of donor origin mediate the beneficial graft-versus-leukemia effect but also induce graft-versus-host disease (GvHD). Since human leukocyte antigens (HLA) mismatch alleles represent major targets of alloreactive T lymphocytes, patient and donor are usually matched for the class I molecules A, B, C, and for the class II molecules DRB1 and DQB1, in order do reduce the risk of GvHD. The HLA-DPB1 locus, however, is still ignored in donor selection. Interestingly, clinical studies have demonstrated that disparities at HLA-DQB1 alleles as well as distinct HLA DPB1 mismatch constellations do not adversely affect the outcome of allo-HSCT. It has also been shown that HLA class II is predominantly expressed on hematopoietic cells under non-inflammatory conditions. Therefore, this PhD thesis focused on the application of CD4 T cells in adoptive immunotherapy of leukemias.rnIn the first part of this thesis we developed a rapid screening approach to detect T-cell reactivity of donors to single HLA class II mismatch alleles. Allo-HLA reactivity was measured in naive, memory, and entire CD4 T cells isolated from PBMC of healthy donors by flow cytometric cell sorting according to expression of the differentiation markers CD45RA, CD45RO, CD62L, and CCR7. T-cell populations were defined by a single marker to facilitate translation into a clinical-grade allo-depletion procedure. Alloreactivity to single HLA-DR/-DQ mismatch alleles was analyzed in short-term mixed lymphocyte reactions (MLR) in vitro. As standard antigen-presenting cells, we used the HLA-deficient cell line K562 upon electroporation with single HLA-DR/-DQ allele mRNA. We observed in IFN-γ ELISpot assays that allo-HLA-reactivity preferentially derived from subsets enriched for naive compared to memory T cells in healthy donors, irrespective of the HLA mismatch allele. This separation was most efficient if CD62L (P=0.008) or CD45RA (P=0.011) were used as marker. Median numbers of allo-HLA-reactive effector cells were 3.5-fold and 16.6-fold lower in CD62Lneg and CD45RAneg memory CD4 T cells than in entire CD4 T cells, respectively. In allele-specific analysis, alloreactivity to single HLA-DR alleles clearly exceeded that to HLA-DQ alleles. In terms of alloproliferation no significant difference could be observed between individual CD4 T-cell subsets. rnThe second part of this thesis dealed with the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cells. Naive CD45RApos CD4 T cells isolated from healthy donor PBMC by flow cytometric cell sorting were stimulated in MLR against single allo-HLA-DQ/-DP alleles transfected into autologous mature monocyte-derived dendritic cells by mRNA electroporation. Rapidly expanding HLA-DQ/-DP mismatch reactive T cells significantly recognized and cytolysed primary acute myeloid leukemia (AML) blasts, fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in IFN-γ ELISpot and 51chromium release assays if the targets carried the HLA DQ/ DP allele used for T cell priming. While AML blasts were recognized independent of pre-incubating them with IFN-γ, recognition of FB and KC required IFN-γ pre treatment. We further investigated HLA class II expression on hematopoietic and non-hematopoietic cells by flow cytometry. HLA class II was not detected on primary FB, KC, and non-malignant kidney cells, but was expressed at significant levels on primary AML blasts and B-LCL. Up-regulation of HLA class II expression was observed on all cell types after pre-incubation with IFN-γ.rnIn summary, the novel K562-HLA based MLR approach revealed that naive-depleted CD4 T-cell subsets of healthy individuals contain decreased allo-HLA reactivity in vitro. We propose the application of CD45RAneg naive-depleted CD4 T cells as memory T cell therapy, which might be beneficial for HLA-mismatched patients at high-risk of GvHD and low-risk of leukemia relapse. Memory T cells might also provide important post-transplant immune functions against infectious agents. Additionally, the screening approach could be employed as test system to detect donors which have low risks for the emergence of GvHD after allo-HSCT. In the second part of this thesis we developed a protocol for the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cell lines, which could be applied in situations in which patient and donor are matched in all HLA alleles but one HLA-DQ/-DP allele with low GvHD potential. These T cells showed lytic activity to leukemia cells while presumably sparing non-hematopoietic tissues under non-inflammatory conditions. Therefore, they might be advantageous for allo-HSCT patients with advanced stage AML after reduced-intensity conditioning and T-cell depletion for the replenishment of anti-leukemic reactivity if the risk for disease relapse is high. rn
HLA Klasse II Mismatch-Allele als Zielstrukturen der alloreaktiven CD4 T-Zell-Antwort rnIn der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (allo-HSZT) lösen alloreaktive T-Lymphozyten des Spenders sowohl den heilenden Graft-versus-Leukämie Effekt als auch die unerwünschte Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) aus. Die GvHD ist eine Hauptursache für die Morbidität und Mortalität der Patienten. Da HLA-Moleküle die wichtigsten Zielstrukturen der Spender T-Zellen darstellen, sollten Spender und Empfänger in allen HLA Klasse I (A, B, C) und den HLA Klasse II Allelen DRB1 und DQB1 übereinstimmen. Der HLA Klasse II DPB1 Locus wird bis heute bei der Spenderwahl nicht miteinbezogen. Interessanterweise konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass Unterschiede (Mismatches) in den DQB1 Allelen sowie einigen DPB1 Allelen GvHD und Überleben nach allo-HSZT nicht negativ beeinflussen. Da HLA Klasse II Moleküle unter nicht inflammatorischen Bedingungen überwiegend auf hämatopoetischen Zellen exprimiert werden, untersucht diese Doktorarbeit den möglichen Einsatz von CD4 T-Zellen, die gegen HLA Klasse II Mismatch Moleküle gerichtet sind, in der adoptiven Immuntherapie von Leukämiepatienten. rnIm ersten Teil der Arbeit wurde eine Screeningmethode entwickelt, mit welcher die T-Zell-Reaktivität eines Spenders gegenüber einzelnen HLA Klasse II Mismatch Allelen in vitro detektiert werden kann. Hierfür wurden Blutlymphozyten gesunder Spender mittels durchflusszytometrischer Sortierung basierend auf der Expression der Differenzierungsmarker CD45RA, CD45RO, CD62L und CCR7 in naive und memory CD4 T-Zell-Fraktionen aufgetrennt und mit der Gesamtheit aller CD4 T-Zellen verglichen. Die allo-HLA-Reaktivität dieser Populationen wurde anschließend in gemischten Kurzzeit-Lymphozytenkulturen (MLR) analysiert. Dabei dienten HLA-defiziente K562-Zellen, die mittels mRNA Elektroporation mit einzelnen DRB1/DQB1 Allelen transfiziert wurden, als antigen-präsentierende Zellen. IFN-γ ELISpot Assays zeigten, dass die allo-HLA-Reaktivität, unabhängig vom untersuchten HLA Allel, vorwiegend in naiv-angereicherten T-Zell-Fraktionen liegt. Unterschiede in der Alloreaktivität zwischen naiven und memory Populationen waren am größten, wenn CD62L (P=0,008) oder CD45RA (P=0,011) als Marker für die Zellsortierung verwendet wurden. Im Median wurden 3,5-mal weniger alloreaktive Effektorzellen in CD62Lneg und 16,6-mal weniger in CD45RAneg memory T-Zell-Populationen beobachtet, als im gesamtem CD4 T-Zell-Kompartiment. Daher könnte der Einsatz CD45RAneg naiv-depletierter CD4 T-Zellen als „Memory T Zell-Therapie“ für Patienten mit hohem GvHD Risiko ohne HLA-identem Spender von Vorteil sein. Memory T-Zellen könnten nach der allo-HSZT wertvolle Immunfunktionen gegen Infektionen bereitstellen. Allerdings enthalten diese Zellen vergleichsweise geringe Leukämiereaktivität, was durch den Einsatz leukämie-vorstimulierter memory T-Zellen oder leukämiereaktiver T Zellen, die aus dem naiven Kompartiment spezifisch isoliert wurden, ergänzt werden könnte. Das hier etablierte Screening System könnte dazu genutzt werden, Spender/Patienten Paare mit geringem GvHD-Risiko zu identifizieren. rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die in vitro Generierung von HLA-DQ/-DP Mismatch-reaktiven CD4 T-Zelllinien entwickelt, die eingesetzt werden können, wenn Spender und Patient in allen HLA Merkmalen außer einem definierten HLA-DQ/-DP Allel übereinstimmen. Hierfür wurden naive CD45RApos CD4 T Zellen mittels durchflusszytometrischer Sortierung aus gesunden Spenderlymphozyten isoliert und in einer MLR mit autologen reifen dendritischen Zellen stimuliert, die ein einzelnes allogenes mittels mRNA Elektroporation transfiziertes HLA-DQ/-DP Allel exprimieren. Die expandierenden allo-HLA-DQ/-DP spezifischen CD4 T Zellen erkannten und lysierten primäre akute myeloische Leukämieblasten (AML), Fibroblasten (FB) und Keratinozyten in IFN-γ ELISpot und 51Chrom-Release Assays, wenn die Targets das HLA-Allel trugen, welches für das vorangehende T-Zell Priming verwendet wurde. AML Blasten wurden im Gegensatz zu FB und KC unabhängig von einer Vorinkubation mit IFN-γ erkannt. Zusätzlich wurde die HLA Klasse II Expression auf hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen mittels Durchflusszytometrie untersucht. Auf primären FB, KC und nicht-malignen Nierenzellen konnte keine Expression der HLA II Moleküle detektiert werden, während AML Blasten und EBV-B transformierte lymphoblastoide B-Lymphozyten diese in signifikanten Mengen exprimierten (DP>DR>DQ). Auf allen Zelltypen wurde eine Steigerung der Expression nach Inkubation mit IFN-γ beobachtet. Die allo-HLA-DQ/-DP spezifischen CD4 T-Zellen sollten somit unter nicht-inflammatorischen Bedingungen Leukämiezellen lysieren, während nicht-hämatopoetisches Gewebe unbetroffen bliebe. rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4399
URN: urn:nbn:de:hebis:77-33722
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 105 S.
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