Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4358
Authors: Ostertag, Michael Rainer
Title: Charakterisierung einer pflanzlichen Variante des Cytoskelettproteins gamma-Tubulin durch Strukturmodellierung, Überexpression und Analyse der Interaktionspartner
Online publication date: 9-Jan-2013
Year of first publication: 2013
Language: german
Abstract: Wie alle Eukaryoten besitzen auch höhere Pflanzen ein mikrotubuläres Cytoskelett. Einige Funktionen dieses Cytoskeletts sind relativ stark konserviert, andere dagegen scheinen sehr pflanzenspezifisch zu sein. Dies betrifft insbesondere charakteristische mikrotubuläre Netzwerke, die bei der Neubildung und der Verstärkung der Zellwände wichtige Rollen übernehmen. Wie der Aufbau dieser Netzwerke kontrolliert wird, ist bisher relativ unklar. Typische Mikrotubuli organisierende Zentren (MTOC), insbesondere Centrosomen oder Spindelpolkörper, sind bei höheren Pflanzen nicht beobachtet worden. Von pilzlichen und tierischen Organismen weiß man, dass gamma-Tubulin (gTUB) mit seinen assoziierten Proteinen in den MTOC bei der Nukleation von Mikrotubuli eine Schlüsselfunktion hat. Dieses Mitglied der Tubulin-Superfamilie wird aber auch in Pflanzen gefunden, dessen genaue Funktion bisher unbekannt ist. Zu Beginn der Arbeit wurden mittels in silico Berechnungen Strukturmodelle des pflanzlichen gTUBs aus Nicotiana tabacum erarbeitet, da die Struktur, die zu einem Verständnis der pflanzlichen Wachstumsregulation beitragen könnte, bisher unbekannt ist. Auf Grundlage der bioinformatischen Daten konnte für weitere Studien eine notwendige gTUB-Deletionsmutante entwickelt werden. Für Röntgendiffraktionsstudien und gTUB-Interaktionspartneranalysen war die Verfügbarkeit verhältnismäßig großer Proteinmengen notwendig. Die Expression der gTUB-Volllängensequenz in gelöster und aktiver Form stellte einen immanent wichtigen Zwischenschritt dar. Das Escherichia coli T7/lacO-Expressionssystem lieferte, trotz vielversprechender Erfolge in der Vergangenheit, kein gelöstes rekombinantes gTUB. So wurden zwar verhältnismäßig hohe Expressionsraten erzielt, aber das rekombinante gTUB lag quantitativ als Inclusion bodies vor. Eine Variationen der Expressionsparameter sowie umfangreiche Versuche mittels verschiedenster Konstrukte sowie potentiell die Löslichkeit erhöhenden Tags gTUB in gelöster Form in E. coli zu exprimieren blieben erfolglos. Eine Denaturierung der Inclusion bodies und Rückfaltung wurde aufgrund der wohl bei der Tubulinfaltung notwendigen komplexeren Chaperone sowie thermodynamischer Überlegungen ausgeschlossen. Die höher evolvierte Chaperonausstattung war ein Hauptgrund für die Verwendung der eukaryotischen Hefe-Expressionssysteme K. lactis und des S. cerevisiae-Stammes FGY217 zur gTUB-Expression. So konnten nach der Selektion nur transgene Hefe-Zellen dokumentiert werden, die die gTUB-Expressionskassette nachweislich an der vorgesehenen Zielposition in ihrem Genom integrierten, aber keine dokumentierbare Expression zeigten. Die wahrscheinlichste Begründung hierfür ist, dass ein erhöhter intrazellulärer gTUB-Titer mit dem Zellwachstum und der Zellteilung dieser eukaryotischen Organismen interferierte und durch Rückkopplungen die rekombinante gTUB-CDS aus N. tabacum ausgeschaltet wurde. Der Versuch einer transienten gTUB-Überexpression in differenzierten Blattgeweben höherer Pflanzen war eine logische Konsequenz aus den vorherigen Ergebnissen und lieferte, wenn auch nicht die für eine Proteinkristallisation notwendigen Mengen, gelöstes gTUB. Bestrebungen einer stabilen Transfektion von A. thaliana oder BY-2-Zellkulturen mit einer gTUB-CDS lieferten keine transgenen Organismen, was starke Interferenzen der rekombinanten gTUB-CDS in den Zellen vermuten lies. Transfektionsversuche mit nur GFP tragenden Konstrukten ergaben hingegen eine hohe Anzahl an transgenen Organismen, die auch verhältnismäßig starke Expressionsraten zeigten. Die erzielten Proteinmengen bei der transienten gTUB-Überexpression in N. benthamiana Blattgeweben, in Co-Expression mit dem Posttransriptional Gene Silencing-Suppressorprotein p19, waren für einen Pull-Down sowie eine massenspektroskopische Analyse der Interaktionspartner ausreichend und ergaben Befunde. Eine abschließende Auswertung des erarbeiteten massenspektroskopischen Datensatzes wird jedoch erst dann möglich sein, wenn das Tabak-Proteom vollständig sequenziert ist. Die Erweiterung der bestehenden pflanzlichen Vergleichsdatenbanken um das bisher bekannte Tabak-Proteom vervielfachte die Anzahl der in dieser Studie identifizierten gTUB-Interaktionspartner. Interaktionen mit dem TCP1-Chaperon untermauern die Hypothese der zur Faltung pflanzlichen gTUBs notwendigen Chaperone. Beobachtete gTUB-Degradationsmuster in Verbindung mit Interaktionen des 26S-Proteasoms deuten auf eine Gegenregulationen bei erhöhtem gTUB-Titer auf Proteinebene hin. Da Blattgewebe selbst nur noch über eine sehr geringe und inhomogene Teilungsaktivität verfügen ist diese Regulation hoch spannend. Auch konnte durch Co-Expression des PTGS-Suppressorproteins p19 gezeigt werden, dass bei der gTUB-Expression eine Regulation auf RNA-Ebene erfolgt.
The cytoskeleton of plant cells as well as of every eukaryotic cell is formed by Microtubules. Some Microtubule functions are highly conserved and common but some might be plant specific, especially those microtubule networks which are involved in cell wall formation and strengthening. Nucleation and organization of microtubule network is still quite unknown. Typical Microtubules organizing centers (MTOC), in specific centrosomes or spindle pole bodies, have not been documented until now. It is known that gamma-Tubulin together with associated proteins has a key role in MTOC during Microtubule nucleation in fungi and animals. This member of the Tubulin superfamily has also been documented in plants, but its exact role and function is still not clear. At the beginning of this thesis, several in silico structure models of gamma-Tubulin from Nicotiana tabacum were developed to gather a better understanding of the domains which could participate and have influence in plant specific growth regulation. Based on these structural and phylogenic models it could be shown that the plant specific gamma-A/B-peptides forms helical secondary structures which participate at the polarized solvent accessible surface. These facts provide strong evidence that gamma-A/B-peptide is probably involved in protein-protein interactions. Therefore this domain was selected for further studies. It is known that high amounts of pure protein are essential for x-ray diffraction as well as interaction-partner analysis. Therefore the expression of active and soluble full length gamma-Tubulin was an immanent step. An Escherichia coli T7/lacO expression system could not deliver any soluble gamma-Tubulin, despite recent auspicious results and high yields of protein. Even extensive expression parameter variations (e. g. temperature, inductor and co-expression of chaperones) as well as usage of different constructs with solubility enhancing sequences did not lead to any improvement in soluble protein expression. A refolding of aggregated proteins (known as inclusion bodies) was decided to be unfeasible because of the thermodynamical considerations and the necessity of higher evolved chaperones. The decision to use eukaryotic yeast expression systems (like K. lactis and FGY217) for expression of soluble gamma-Tubulin was based on the higher evolved chaperone system. Molecular genetic tests did prove the gamma-Tubulin expression cassette to be integrated correctly at the target position in the yeast genome. However it was not possible to detect any transgenic organisms, which produce recombinant protein. This fact is most likely related to a regulation feedback caused by the increased gamma-Tubulin titer. Based on the preliminary results overexpression experiments of a transient gamma-Tubulin in a differentiated leaf tissue of higher evolved green plants were conducted. The achieved amounts of soluble recombinant gamma-Tubulin were too low for protein-crystallization experiments but high enough for mass-spectroscopic analysis of interaction partners. Efforts to establish a stable transfected Arabidopsis thaliana and BY-2 cell line were not successful. However control transfections with only GFP carrying expression cassettes were successful. The transient co-expression of the gene silencing suppressor p19 with gamma-Tubulin enhanced the amount of recombinant protein by factor 2 to 3. These results allowed the assumption of strong interferences between the recombinant gamma-Tubulin cds with not yet specified regulation mechanisms on RNA level. The mass-spectroscopic analysis of different pull-down probes allowed to reassess some current partial knowledge regarding gamma-Tubulin interaction partners. Because of limited tobacco proteome reference data, in silico prediction of all known tobacco proteins was included to enlarge the dataset for a better analysis. Besides the obvious interaction partners like alpha- and beta-Tubulin, it was possible to identify Aktin-7,TCP-1 and  GCP-2 as gamma-Tubulin interaction partners. The finding of 26S-Proteasome related proteins fitted to the discovery of an increased degradation pattern, which could be an evidence for potential regulatory activities on protein level.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4358
URN: urn:nbn:de:hebis:77-33168
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 130 S.
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
3316.pdf50.84 MBAdobe PDFView/Open