Autoren:	Lukes, Robert
Titel:	Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System
Online-Publikationsdatum:	23-Apr-2009
Erscheinungsdatum:	2009
Sprache des Dokuments:	Deutsch
Zusammenfassung/Abstract:	Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom- Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden. Mitotic and postmitotic processes of land plant cells are based on the function of microtubules. There is only little ascertainable knowledge about the organisation of this multifunctionality. A central role in the nucleation of microtubules in MTOCs is attributed to γ-tubulin. Their association with MTOCs, however, is still not well understood. Domains, which are exposed on the surface of the protein, might be involved in their interactions. This paper mainly discusses the role of the γ-A and γ-B-peptide regions here. These two areas are strongly conserved within green land plants. They diverge into the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii and Chlorella spec. Therefore, additional γ-A and γ-B-peptide motifs were examined regarding the prevalent phylogentic gap. The organisms were chosen on the basis of the following criteria: uni-/multicellularity, presence/absence of centrioles and possession/absence of flagella. Additional interaction partners were sought with various γ-tubulin constructs around these γ-A and γ-B-peptide motifs, which were derived from Nicotiana tabacum cells (BY2), by using the Y2H system. The sequence analysis of the γ-A and γ-B-peptide motif could show that the conservation is manifested within the streptophyte lineage, beginning from the unicellular green algae Mesostigma spec. It is interesting to note that this conserved motif only appears in the γ-A-peptide motif within zygnematales, which also belong to streptophytes. It is possible that both potential interaction motifs (γ-A and γ-B) each have an interaction partners of their own. Several sequences were identified through the application of a GAL4 protein-based Y2H system including different γ-tubulin AB-constructs as bait and a cDNA library as prey. The following sequences were identified: poly (A)-binding protein, glycerol aldehydy-3-phosphate dehyrogenase, S-adenosyl-L-methionine synthetase, various proteasome subunits, a secretory peroxydase, an ascorbate peroxydase, the peroxydase NtPOX1 and various peroxydases from Nicotiana tabacum, sequences of the chloroplast genome, a myosin-like protein, a sequence on the 5th chromosome of the Medicago truncatula clone, namely mth2-16f8, and several human sequences of the protein DKFZp68 and DKFZp77. The results suggest a complex function of the different components of the plant’s cytoskeleton and of γ-tubulin. For further investigation, other genetic, biochemical or functional methods would have to be used in the future. Hypotheses about interactions of the components of the cytoskeleton can probably not be evaluated solely through the use of the Y2H system.
DDC-Sachgruppe:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Veröffentlichende Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit:	FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4328
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-19789
Version:	Original work
Publikationstyp:	Dissertation
Nutzungsrechte:	Urheberrechtsschutz
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Enthalten in den Sammlungen:	JGU-Publikationen