Authors:	Theobald, Sascha
Title:	Isolierung und Identifizierung von wachstumsfördernden Substanzen für das weinrelevante Bakterium Oenococcus oeni aus Fruchtsäften und Blattextrakten
Online publication date:	18-Mar-2009
Year of first publication:	2009
Language:	german
Abstract:	Neben Tomatensaft wurde eine Vielzahl von Säften und Blattextrakten als Medienzusätze auf Wachstumsförderung bei 30 verschiedenen Oenococcus oeni-Stämmen getestet. Es zeigte sich eine breite Wachstumsförderung bei allen Zusätzen mit Ausnahme von Zitronensaft, sodass die Wachstumsfaktoren keine tomatenspezifischen Inhaltsstoffe sein können und eher ubiquitär in der Pflanzenwelt vorkommen. Das Ausmaß der Wachstumsförderung war stammabhängig sehr unterschiedlich und Tomatensaft stellte keineswegs für alle Stämme den optimalen Medienzusatz dar. Durch Schälen der Früchte war eine für die Analytik hilfreiche Abtrennung schalenspezifischer Inhaltsstoffe möglich, wobei auch die Schalenextrakte großes Potential für die Suche nach Wachstumsfaktoren offenbarten und die Wichtigkeit einer Auftrennung der Frucht in die verschiedenen Fruchtbereiche betonte. Aus Tomatensaft konnte analytisch der anorganische Wachstumsfaktor Mangan identifiziert werden. Die größten Zelldichten der Oenokokken-Stämme wurden hierbei bei 67 µM und 34 mM Manganzusatz erreicht. Bei 13 von 20 getesteten Oenokokkenstämmen konnte bei Zusatz von 34 mM Mangan der Tomatensaft ersetzt werden, bei 4 Stämmen (z. B. Stamm B2) fehlten jedoch noch weitere Wachstumsfaktoren und bei 3 Stämmen (z. B. Stamm B120) kam es zu einem verfrühten Absterben. Da weitere Mineralstoffe sowie veraschte Säfte und Blattextrakte keinen positiven Einfluß auf die Oenokokken-Zelldichte hatten, wurde mittels semipräparativer HPLC nach zusätzlichen organischen Wachstumsfaktoren für den Stamm B2 gesucht. Hierzu wurde der nachfolgende Wachstums-Assay miniaturisiert und erfolgreich auf Microtiterplatten etabliert. Es gelang die Isolierung und Identifizierung eines wachstumsfördernden Trisaccharides aus Mangoschalen-Extrakt, das aus den Zuckern Glucose, Rhamnose und Arabinose bestand. Von den monomeren Zuckern erhöhte lediglich die Arabinose die Zelldichte, das Optimum lag bei 1,5 g/l. Auch aus Zitronenmesokarp-Extrakt war die Isolierung eines wachstumsfördernden arabinosehaltigen Disaccharides möglich, die Menge reichte jedoch noch nicht für eine genaue Identifizierung aus. Desweiteren erwies sich 1,5 g/l Cystein als wachstumsstimulierend. Ein Zusatz aller gefundenen Wachstumsfaktoren (34 mM Mangan, 1,5 g/l Arabinose und 1,5 g/l Cystein) ersetzte den Tomatensaft bei weiteren Oenokokken-Stämmen (z.B. Stamm B120) komplett, wobei bei allen Stämmen sogar eine schnellere Anzucht erfolgte. Neben dem Tomatensaft war auch der Zusatz von Hefeextrakt zum Grundmedium nicht mehr nötig, sodass ein neues vereinfachtes Medium für die Anzucht von Oenokokken mit komplexen Nährstoffansprüchen vorgeschlagen werden konnte. Lediglich beim Stamm B2 zeigte sich noch ein OD-Unterschied von 0,2 in der stationären Phase, der nach Adsorptionsversuchen an Polyvinylpolypyrrolidon auf noch unidentifizierte Polyphenole im Tomatensaft zurückzuführen ist. Aus grünem Tee erwies sich das Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG) konzentrationsabhängig sowohl als Hemmstoff (>550 mg/l EGCG) als auch Wachstumsfaktor (400-500 mg/l EGCG) für den Oenokokken-Stamm B2. Der hemmende als auch der fördernde Einfluss auf das Wachstum wurde mittels Sytox/DAPI-Färbung bestätigt. Der sogenannte „Tomatensaft-Faktor“ ist also nicht eine spezielle Substanz, sondern das synergistische Zusammenwirken mehrerer einfacher Substanzen wie Mineralstoffe, Aminosäuren, Kohlenhydrate und Polyphenole. Auch sind die Oenokokken-Stämme bezüglich ihres Nährstoffbedarfes sehr unterschiedlich, sodass für jeden Stamm einzeln das optimale Substratspektrum ermittelt werden muss. Besides tomato juice many other juices and leaf extracts were tested as medium additives for growth enhancement on 30 different Oenococcus oeni strains. A broad growth enhancement showed up with all additives with exception of lemon juice. So the growth factors could not be specific ingredients of tomatoes but substances with rather ubiquitously occurence in the plant world. The extent of the growth enhancement was very different dependent by the Oenoccus oeni strains. Hereby tomato juice did not represent the best medium additive for all strains. The peeling of the fruits was very useful for analytics because it allowed an easy separation of substances which occur only in the peel. Hereby also the peel extracts revealed a large potential for the search of growth factors and showed the importance of a differentiation of the fruit in inner and outer parts. Manganese was identified as inorganic growth factor of tomato juice. The highest cell densities of the Oenococcus oeni strains could be achieved with 67 µM and 34 mM manganese as medium additive. The addition of 34 mM manganese could replace tomato juice for 13 of the tested 20 Oenococcus oeni strains. However four Oenococcus oeni strains (for example strain B2) still needed further growth factors and it came to an early death phase for three other Oenococcus oeni strains (for example strain B120). Other minerals as well as the ashes of the juices and leaf extracts did not have a positive effect on the cell densities of Oenococcus oeni. So it was searched for additional organic growth factors for Oenococcus oeni strain B2 by separation of the juices with semi-preparative HPLC. The following growth assay was miniaturized and successfully established on microtiter plates. By these means the isolation and identification of a growth-stimulating trisaccharide from mangopeel extract could be achieved. It consisted of the sugars glucose, rhamnose and arabinose.From these sugars only arabinose increased the cell density of Oenococcus oeni strain B2. The optimum concentration was 1,5 g/l. The isolation of another growth-stimulating disaccharide was possible from lemon mesocarp extract. Arabinose could be identified as a constituent of this disaccharide, but the isolated quantity was too small to allow an exact identification of the substance. Furthermore cystein enhanced the growth of Oenococcus oeni strain B2 in a concentration of 1,5 g/l. The use of all found growth factors (34 mM manganese, 1.5 g/l arabinose and 1.5 g/l cystein) together as medium additive replaced the use of tomato juice for further Oenococcus oeni strains (e.g. strain B120) and also resulted in a shorter lag phase. Besides tomato juice also the addition of yeast extract to the basal medium was not necessary anymore so that a new simplified medium for the growth of Oenococcus oeni strains with complex nutritional requirements could be suggested. Only Oenococcus oeni strain B2 needed further growth factors because there was still a difference in the cell density of 0,2 in the stationary phase compared to tomato juice medium. Adsorption tests with polyvinylpolypyrrolidon showed that these still unknown growth factors in tomato juice belong to the class of polyphenols. Epigallocatechin gallate (EGCG) is a polyphenol from green tea which had a growth-stimulating (400-500 mg/l EGCG) as well as a growth inhibiting effect (> 550 mg/l EGCG) on Oenococcus oeni strain B2 depended on its concentration in the culture medium. Both effects were confirmed by cell counting after the use of sytox and DAPI as fluorescent colorants for Oenococcus oeni. Thus the so called „tomato juice factor“ is not a special single substance but the synergistic cooperation of several simple substances such as minerals, amino acids, carbohydrates and polyphenols. The Oenococcus oeni strains are also very different concerning their nutritional requirements so that the best culture medium needs to be determined for each strain separately.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4311
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-19247
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen