Authors:	Wesarg, Emmanuelle
Title:	Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes
Online publication date:	16-Mar-2009
Year of first publication:	2009
Language:	english
Abstract:	Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination. Bisherige therapeutische Impfungen bei Krebserkrankungen basierten auf wenige T-Zell-Epitopen, die von häufig exprimierten strukturell normalen tumorassoziierten Antigenen (TAA) prozessiert und über häufige HLA-Allele präsentiert werden. Die Individualität der Interaktionen zwischen Tumor und Wirt wurde bis jetzt nicht oder nur selten berücksichtigt. Diese Interaktionen werden nicht nur von der Antigen-Expressionspattern des Tumors oder dem individuellen HLA-Polymorphismus, sondern auch von dem individuellen T-Zell-Repertoire bestimmt. Die in dieser Arbeit beschriebene Prozedur wurde entwickelt, um Antigene zu identifizieren, die aus einem Panel von bekannten TAA präferentielle Ziele des individuellen Repertoire darstellen. Lymphozyten wurden aus dem peripheren Blut von Tumorpatienten oder gesunden Spendern isoliert und mit autologen mRNA-transfizierten FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003) zweimal stimuliert. FastDC wurden aus Monozyten generiert und via Lipofektion mit für die Panel-Antigene kodierenden in vitro transkribierten mRNAs getrennt transfiziert. Stimulierte Lymphozyten wurden am Tag 12 in einem 20h IFN-g ELISPOT Assay auf Reaktivität gegen 293T Zellen, transfiziert mit Plasmid-Paaren kodierend für das Stimulationsantigen und eins der individuellen HLA class I Allele, getestet. In einer ersten Phase wurden die Stimulationsparameter für den Nachweis von anti-HCMV pp65 Antworten optimiert. Maximale Amplifikation der pp65-spezifischen CD8+ T-Zellantworten wurde mit einer IL-2 Konzentration von 25 IU/ml und einem minimalen APC:Effektor Ratio von 1:10 erzielt. Stimulationspotential wurde durch Zusatz von IL-4, IL-7 oder IL-15 nicht erhöht. Die Prozedur wurde auf zwei humanen Melanoma Modellen -D05 und MZ2- angewendet. In beiden Modellen waren zahlreiche T-Zell definierte Antigene mittels Expression Screening identifiziert worden. Blut Lymphozyten wurden mit autologen Tumorzellen oder mRNA-transfizierten FastDC stimuliert. In D05 wurden T-Zell-Antworten gegen drei von elf Epitopen, die durch Tumor Stimulation induziert wurden, auch nach Stimulation mit mRNA-transfizierten FastDC gefunden. Zwei weiteren Epitope wurden mit mRNA- aber nicht mit Tumor Stimulation identifiziert. In MZ2 konnten T-Zell-Antworten gerichtet gegen fünf verschiedenen Epitope am Tag 12 nach Stimulation mit mRNA-Transfektanten nachgewiesen werden. Diese Antworten wurden erst am Tag 32 nach Stimulation mit den Tumorzellen nachgewiesen. mRNA-Stimulationen gegen 21 TAA und dem HCMV pp65 Antigen wurden in vier gesunden Spendern durchgeführt. CD8+ T-Zellen gegen pp65 wurden in allen Spender expandiert. Unter den TAA, konnte nur Reaktivität gegen Melan-A/MART-1 in Verbindung mit HLA-A*0201 in einem Spender nachgewiesen werden. Die Impfung von Tumorpatienten mit Antigenen, die a priori als Ziele des individuellen T-Zellrepertoire identifiziert wurden, sollte dazu beitragen, bessere klinische Ergebnisse bei therapeutischen Vakzinierungen zu erzielen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4308
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-19181
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen