Authors:	Mersch, Christian
Title:	Synthese von MUC1-Glycopeptid-Konjugaten mit fluorierten Analoga des Thomsen-Friedenreich-Antigens
Online publication date:	24-Jul-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Krebserkrankungen gehen oft mit der Überexpression von mucinartigen Glycoproteinen auf der Zelloberfläche einher. In vielen Krebserkrankungen wird aufgrund der fehlerhaften Expression verschiedener Glycosyltransferasen das transmembranständige Glycoprotein MUC1, mit verkürzten Glycanstrukturen, überexprimiert. Das Auftreten der verschiedenen tumor-assoziierten Antigene (TACA) korreliert meist mit dem Fortschreiten des Krebs und der Metastasierung. Daher stellen TACAs interessante Zielmoleküle für die Entwicklung einer aktiven Tumorimmuntherapie zur spezifischen Behandlung von Adenokarzinomen dar. In dieser Arbeit galt das Interesse dem epithelialen Mucin MUC1, auf Basis dessen ein synthetischer Zugang zu einheitlichen Antitumorvakzinen, welche aus mucinanalogen Glyco-peptid¬konjugaten des MUC1 und Carrierproteinen bestehen, hergestellt werden sollten.rnUm eine tumorspezifische Immunantwort zu erhalten, müssen die selbst schwach immunogenen MUC1-Antigene über einen nicht-immunogenen Spacer mit einem geeigneten Trägerprotein, wie Tetanus Toxoid oder Rinderserumalbumin (BSA), verbunden werden. rnDa ein Einsatz von Glycokonjugaten in Impfstoffen durch die metabolische Labilität der O-glycosidischen Bindungen eingeschränkt ist, wurden hierzu erstmals fluorierte Vetreter von MUC1-analogen Glycopeptiden verwendet, in denen das Kohlenhydrat-Epitop durch den strategischen Einbau von Fluor¬atomen gegenüber einem raschen Abbau durch Glycosidasen geschützt werden soll. Dazu wurden auf Basis des literaturbekannten Thomsen-Friedenreich-Antigens Synthesestrategien zur Herstellung eines 2â F- und eines 2â ,6â -bisfluorierten-Analogons erarbeitet. rnSchlüsselschritte in der Synthese stellten neben der elektrophilen Fluorierung eines Galactalvorläufers auch die ï ¢-selektive 3-Galactosylierung des TN-Antigen-Bausteins zum 2â F- und 2â ,6â -bisfluorierten-Analogons des TF-Disaccharids dar. Durch entsprechende Schutzgruppentransformationen wurden die beiden Derivate in entsprechende Glycosyl¬amino-säure-Bausteine für die Festphasensynthese überführt.rnNeben den beiden Analoga des TF-Antigens wurde auch erstmals ein 2F-Analogon des 2,6-Sialyl-T-Antigens hergestellt. Dazu wurde der entsprechende 2â F-TF-Baustein mit Sialinsäure-xanthogenat nach bereits bekannten Syntheseprotokollen umgesetzt. Aufgrund von Substanzmangel konnte die Verbindung nicht zur Synthese eines MUC1-Glycopeptid-Analogons herangezogen werden.rnDer Einbau der hergestellten Glycosylaminosäure-Bausteine erfolgte in die aus 20 Amino-säuren bestehende vollständige Wiederholungseinheit aus der tandem repeat-Sequenz des MUC1, wobei die entsprechenden Glycanseitenketten stets in Position 6 eingeführt wurden. Um die erhaltenen Glycopeptide für immunologische Studien an Carrier-Proteine anbinden zu können und so ggf. zu funktionsfähigen Impfstoff-Konjugaten zu gelangen, wurden diese stets N-terminal mit einem nicht-immunogenen Triethylenglycol-Spacer verknüpft. Die anschließende Funktionalisierung mit Quadratsäurediethylester erlaubte die spätere chemoselektive Konjugation an Trägerproteine, wie Tetanus Toxoid oder BSA.rnIn ersten immunologischen Bindungsstudien wurden die synthetisierten BSA-Glycopeptid-Konjugate mit Serum-Antikörpern aus Vakzinierungsstudien von MUC1-Tetanus Toxoid-Konjugaten, die (i) eine natürliche TF-Antigenstruktur und (ii) ein entsprechendes TF-Antigenderivat mit Fluorsubstituenten an C-6 des Galactosamin-Bausteins und C-6â des Galactoserests tragen, untersucht.rn Malignancies are frequently associated with the over-expression of mucin-type glycoproteins on the cell-surface. Due to their modified expression of different glycosyltransferases in many carcinomas the transmembran glycoprotein MUC1 is over-expressed on cancer cells. The apperance of various tumor-associated carbohydrate antigens (TACA) correlate with the progression of cancer and the formation of metastasis. Therefore TACAs play an important role in the development of carbohydrate-based cancer vaccines for active immunotherapy against adenocarcinoma.rnIn this study, there was interest in the epithelial mucin MUC1, based on which a synthetic access to consistent anti-tumor vaccines, which consist of glycopeptides of mucin MUC1 and carrier proteins, should be produced. To obtain an immune response the weakly immunogenic MUC1 antigens have to be connected by a non-immunogenic spacer with an appropriate carrier protein like Tetanus Toxoid or bovine serum albumin.rnAs an application of glycoconjugates in vaccines is restricted by the metabolic lability of the O-glycosidic bonds, we used the first time fluorinated molecules from MUC1-glycopeptide analogs in which the carbohydrate epitope should be protected through the strategic incorporation of fluorine against a rapid degradation by Glycosidases. Based on the known synthesis of the Thomsen-Friedenreich antigen synthetic pathways to 2â F and 2â ,6â -bisfluorinated analogs were developed.rnKey-steps in the synthesis oh theses fluorinated Analogs are the electrophilic fluorination of Galactal-precursors and the ï ¢-selective 3-galactosylation of the TN-antigen building block. Both fluorinated disaccharides could be used after protecting-group transformation for solid-phase synthesis.rnBesides the two analogues of the TF antigen was the first time produced a 2F-analogue of 2,6-sialyl-T antigen. The synthesis of the fluorinated 2,6-sialyl-T-Antigen was performed using an already known synthetic protocol with with sialic acid xanthate. Due to lack of substance it could not used for synthesis of a MUC1 glycopeptide analogue.rnThe incorporation of the fluorinated glycosyl amino acid building blocks were performed in place consisting of a 20 amino acids existing complete tandem repeat unit of MUC1. The respective glycan side-chains were always introduced in position 6. To use the synthesized glycopeptides in immunological studies, they were always linked N-terminal with a non-immunogenic triethyleneglycol spacer to connect them to carrier-proteins and could be used as workable vaccine conjugates.rnThe subsequent functionalization with diethyl squarat allowed the subsequent chemo selective conjugation to carrier proteins such as tetanus toxoid or BSA. In the first immunological binding studies of the synthesized BSA glycopeptide conjugates with serum antibodies from vaccination studies of MUC1-tetanus toxoid conjugates (i) the natural TF-antigen structure and (ii) the corresponding TF-antigen derivative with fluorine at C-6 of galactosamine-building block and carry C-6 'of the galactose residue were investigated.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4293
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-37987
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	246 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen