Authors:	Böckler, Andreas
Title:	Synthese und Charakterisierung biologischer Hybridpolymere zur gentechnologischen Anwendung
Online publication date:	17-Jul-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	KurzfassungrnrnZiel der vorliegenden Arbeit war es eine gezielte, hochspezifische Inhibierung der Proteinbiosynthese zu erreichen. Dies kann durch eine Blockierung des mRNA-Strangs durch komplementäre DNA/RNA-Stränge (ähnlich zur Antisense-Methode) oder durch die Hydrolyse des mRNA-Strangs mit Hilfe spezieller Enzyme (RNasen) realisiert werden. Da jedoch beide Methoden nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen führen, wäre deshalb eine Kombination aus beiden Methoden ideal, welche in einer spezifischen, gezielten und permanenten Ausschaltung der Proteinbiosynthese resultieren würde. Um dieses Ziel zu verwirklichen, ist es nötig, ein Molekül zu synthetisieren, welches in der Lage ist selektiv an einer spezifischen Position an den RNA-Strang zu hybridisieren und anschließend den RNA-Strang an dieser zu hydrolysieren. Der große Vorteil dieses Konzepts liegt darin, dass die DNA-Sequenz für die Hybridisierung an die entsprechende RNA maßgeschneidert hergestellt werden kann und somit jede RNA gezielt angesteuert werden kann, was letztendlich zu einer spezifischen Inhibierung der korrespondierenden Proteinbiosynthese führen soll.rnDurch die Verwendung und Optimierung der Nativen Chemischen Ligation (NCL) als Konjugationsmethode konnten zwei Biomakromoleküle in Form einer 46-basenlangen DNA (komplementär zum RNA-Strang) und einer 31-aminosäurelangen RNase kovalent verknüpft werden. Durch unterschiedliche chemische und molekularbiologische Analysemethoden, wie PAGE, GPC, CE, MALDI-ToF-MS etc., war es zudem möglich, die erfolgreiche Synthese dieses biologischen Hybridpolymers als monodisperses, reines Produkt zu bestätigen. rnDie Synthese des ca. 800-basenlangen RNA-Strangs, der als Modell-Matrize für die selektive und spezifische Degradierung durch das DNA-RNase-Konjugat dienen sollte, konnte unter Zuhilfenahme gentechnologischer Standard-Methoden erfolgreich bewerkstelligt werden. Weiterhin konnte durch die Verwendung der radioaktiven cDNA-Synthese gezeigt werden, dass das DNA-RNase-Konjugat an die gewünschte Stelle des RNA-Strangs hybridisiert. Die Identifizierung einer anschließenden spezifischen Hydrolyse des RNA-Strangs durch die an den DNA-Strang angeknüpfte RNase war aufgrund der geringen katalytischen Aktivität des Enzyms bisher allerdings nicht möglich.rn SummaryrnrnThe aim of the present work was to specifically inhibit the protein biosynthesis. This can be achieved by either blocking the mRNA strand with a complementary DNA/RNA strand (similar to antisense) or by hydrolyzing the mRNA strand with specific enzymes (RNases). Both methods have their respective flaws. Ideally, a combination of both methods would result in a specific, target-oriented and permanent break down of protein biosynthesis. In order to achieve this goal it is necessary to synthesize a molecule capable of selective hybridization and subsequently able to hydrolyze the RNA strand at a known position. The major advantage of this technique would be that the DNA sequence can be tailored for hybridizing to specific RNA sequences thus making it possible to target and inhibit a specific protein biosynthesis.rnBy using and optimizing native chemical ligation (NCL) as a coupling technique a 46-base long DNA (complementary to the RNA strand) and a 31-amino acid long RNase were covalently linked. Chemical and molecular biological characterization methods including PAGE, GPC, CE, MALDI-ToF-MS were used to confirm the successful and monodisperse synthesis of this biological, highly pure hybrid polymer (DNA-RNase-conjugate). rnGenetic engineering was used to create a 800-base long RNA strand as a model system to be exposed to specific cleavage by the DNA-RNase-conjugate. Furthermore, it was shown by radioactive cDNA synthesis that the DNA-RNase-conjugate hybridized to the desired sequence of the RNA strand. Unfortunately, a following hydrolyzation of the RNA strand by the RNase part of the DNA-RNase-conjugate was not clearly detectable due to the lack of catalytic activity of the enzyme.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4288
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-37930
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	213 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen