Authors:	Gotthardt, Katherina Kirsten
Title:	Die Rolle von gamma2-Adaptin im endo-lysosomalen Proteintransport von Säuger-Zellen
Online publication date:	18-Jul-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Ziel der Arbeit war es, die physiologische Funktion von ï §2-Adaptin zu charakterisieren. ï §2 Adaptin wurde 1998 erstmals von Takatsu et al. und Lewin et al. als mögliches Mitglied der Clathrin-Adapter-Proteinfamilie beschrieben. Seine genaue physiologische Funktion ist aber bis heute noch unklar. Bisherige Ergebnisse deuten darauf hin, das ï §2-Adaptin unabhängig von den AP-Komplexen wirkt. \r\nIn der HBV-Morphogenese ist eine spezielle Funktion von ï §2-Adaptin bekannt, da es dort nach seiner Ubiquitinierung durch Nedd4 als Adapter zwischen dem HBV L- und Core-Protein fungiert und Änderungen in der ï §2 Konzentration die HBV-Freisetzung blockieren.\r\nï §2-Adaptin besitzt neben den für die Clathrin-Adapter Proteine typischen Clathrin-bindenden Eigenschaften auch die Fähigkeit, Ubiquitin über sein UIM zu binden. Darüberhinaus wird ï §2-Adaptin durch seine Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 selbst ubiquitiniert. Damit besitzt ï §2-Adaptin typische Eigenschaften eines Ubiquitin-Adapters. ï §2-Adaptin ist an MVBs lokalisiert und Abweichungen in der ï §2 Konzentration verändern die MVB-Morphologie. Zudem führt die Überexpression von ï §2-Adaptin zur Blockade der Freisetzung retroviraler VLPs und die ï §2 Depletion blockiert den lysosomalen Abbau von EGF, einem Substrat des endo-lysosomalen Proteintransports. Dies alles deutet auf eine mögliche Funktion von ï §2-Adaptin in diesem Transportsystem hin, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurde.\r\nEs konnte gezeigt werden, dass die Depletion von ï §2-Adaptin den Abbau von endogenen (z.B. EGF, ubiquitinierte Proteine) und exogenen (z.B. das retrovirale MLV.gag-Polyprotein) Substraten des endo-lysosomalen Weges inhibiert, während sie bei ï §2 Überexpression verstärkt abgebaut werden. Alle bisher identifizierten â Substrateâ von ï §2 Adaptin, also Proteine, die durch überschüssiges ï §2-Adaptin abgebaut werden, besitzen eine Verbindung zum endo-lysosomalen System und / oder zur Ubiquitin-Maschinerie der Zelle. Weitere Hinweise auf eine Rolle von ï §2 Adaptin im MVB-Weg lieferte die Identifikation von Vps28 und Chmp2A als spezifische Interaktionspartner von ï §2-Adaptin. Über Vps28 erhält ï §ï ²-Adaptin direkten Zugang zum ESCRT-I- und über Chmp2A zum ESCRT-III-Komplex. \r\nZudem konnte neben dem UIM eine PH-Domäne in ï §2-Adaptin als wichtige funktionelle Domäne identifiziert werden. Sie stellt das Modul für die Interaktion mit Rab7 dar, welche erstmals gezeigt werden konnte. Auch die Interaktion mit Rab7 deutet auf eine Rolle von ï §2 Adaptin im endo-lysosomalen Transportsystem hin, da Rab7 an späten Endosomen lokalisiert ist und u.a. die Fusion der MVBs mit den Lysosomen vermittelt. Da die Auswirkungen der Rab7-Überexpression und Depletion auf MLV.gag denen der ï §2 Überexpression bzw. Depletion entsprechen, liegt die Vermutung nahe, dass ï §2-Adaptin an einem ähnlich späten Schritt im endo-lysosomalen Transportsystem wirkt wie Rab7. Jedoch blockiert überschüssiges ï §2 Adaptin die ESCRT-abhängige VLP-Ausschleusung an der Plasmamembran und fungiert daher möglicherweise als negativer Regulator der ESCRT-Kaskade. Da die Überexpression von ï §ï ²-Adaptin aber gleichzeitig zum vermehrten lysosomalen Abbau führt, ist eine Funktion von ï §2-Adaptin bei der MVB-Lysosomen-Fusion wenig wahrscheinlich. Einer solchen Funktion widerspricht auch, dass die intrazelluläre Konzentration von Rab7 und Vps28 durch überschüssiges ï §2-Adaptin reduziert werden. \r\nAls dritte funktionell wichtige Domäne in ï §2-Adaptin konnte ein LIR-Motiv identifiziert werden, über welches ï §ï ²-Adaptin mit dem Autophagie-Markerprotein LC3 interagieren kann. Die Interaktion mit LC3, und damit die Verbindung zur Autophagie-Machinerie, liefert eine mögliche Erklärung für den vermehrten Abbau bei ï §2-Überexpression und den Abbau von Proteinen auf der MVB-Oberfläche. Dabei induziert ï §2-Adaptin nicht die Autophagie per se, sondern scheint als Autophagie-Adapter zu wirken, der seine Substrate, z.B. MVBs, selektiv dem Abbau durch Autophagie zuführt. \r\n\r\nEine mögliche Rolle von ï §2-Adaptin im zum Lysosom hin gerichteten zellulären Transport konnte bestätigt werden, wobei ï §2-Adaptin dabei verschiedene Funktionen übernimmt: \r\nï ¶ als Ubiquitin-Adapter im endo-lysosomalen System, \r\nï ¶ als negativer Regulator der ESCRT-Kaskade\r\nï ¶ und / oder als Autophagie-Adapter.\r\n The aim of this thesis was to characterize the physiological function of ï §2 Adaptin. In 1998, ï §2-Adaptin was characterized by Takatsu et al. and Lewin et al. as a putative member of the clathrin adaptor protein family. Its exact physiological function is not identified yet, but previous studies indicate that it functions independently of the adaptor protein complexes.\r\nDuring HBV-morphogenesis, ï §2-Adaptin adapts a specific role. After its ubiquitination by Nedd4, it functions as an adaptor between HBV L- and Core-proteins. Changes in its concentration result in a blockage of HBV-release.\r\nAs a putative member of the clathrin adaptor protein family, ï §2-Adaptin possesses clathrin-binding ability. In addition, it can bind ubiquitin via its UIM and can interact with the ubiquitin-ligase Nedd4. During this interaction, ï §2-Adaptin itself is ubiquitinated. Therefore, it holds characteristic features of an ubiquitin adaptor. ï §2-Adaptin is localized at MVBs and changes in its concentration cause defects in MVB-morphology. Overexpressed ï §2-Adaptin results in the inhibition of retroviral particle release and its depletion blocks lysosomal degradation of EGF, an endogenous substrate or the endo-lysosomal pathway. These results indicate a possible role of ï §2-Adaptin in the MVB-pathway. Such a function in the endo-lysosomal system was further analyzed in this thesis.\r\nIt could be shown that the depletion of ï §2-Adaptin results in an inhibition of the lysosomal degradation of endogenous and exogenous substrates of the endo-lysosomal pathway, while it was increased during ï §2-overexpression. All identified â ï §2-substratesâ exhibit a connection to the endo-lysosomal system and / or the ubiquitin-machninery of the cell. Further indication of a ï §2-function in the MVB-pathway came from the identification of Vps28 and Chmp2A as specific ï §2-interaction partners. Via these interactions ï §2-Adaptin gets access to the ESCRT-machinery, as Vps28 is a subunit of the ESCRT-I- and Chmp2A of the ESCRT-III-complex. In addition to its UIM, a PH-domain was identified as functional important in ï §2 Adaptin. The PH-domain is the interaction module for the interaction between ï §2-Adaptin and Rab7, which could be shown for the first time. Rab7 is localized to late endosomes and functions in MVB-lysosome-fusion. This enhances the idea of a functional role of ï §2-Adaptin in the MVB-pathway. The effect of Rab7-overexpression and depletion on the MLV.gag-morphogenesis resembles the effect of ï §2-Adaptin. This indicates a function of ï §2-Adaptin during late steps of the endo-lysosomal pathway, similar to Rab7. However, overexpressed ï §2-Adaptin inhibits ESCRT-dependent retroviral particle release from the plasma membrane and therefore might possibly work as a negative regulator of the ESCRT-machinery. As overexpressed ï §2 Adaptin results in an enhanced lysosomal degradation, a role in MVB-lysosome-fusion is not very likely. \r\nAnother newly identified domain in ï §2-Adaptin is the LIR-motif. It enables ï §2-Adaptin to interact with the autophagy marker protein LC3. The interaction between ï §2-Adaptin and LC3 â and therefore a connection to the autophagy machinery - provide a possible explanation for the increased lysosomal degradation during ï §ï ²-overexpression and the degradation of proteins on the MVB outer membrane. Thereby, ï §2-Adaptin does not induce autophagy in principle, but seems to function as an autophagy adaptor, which delivers its substrates, for instance MVBs, to autophagosomal degradation.\r\n\r\nA putative role for ï §2-Adaptin in cellular transport directed to the lysosome was confirmed and ï §2-Adaptin functions at different steps during this process:\r\nï ¶ as an ubiquitin adaptor\r\nï ¶ as a negative regulator of the ESCRT-machniery\r\nï ¶ and / or as an autophagy adaptor.\r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4284
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-37884
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	151 S.
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