Authors:	Lippen, Carina von der
Title:	Untersuchung der DNA-Reparatur in humanen Lymphozyten
Online publication date:	23-Jun-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Oxidative DNA-Schäden, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden kontinuierlich in allen Zellen durch endogene und exogene Noxen gebildet. Ohne eine effektive Reparatur können DNA-Schäden nach erfolgter Replikation als Mutationen fixiert werden und somit die Kanzerogenese initiieren.\r\nUntersuchungsgegenstand dieser Arbeit war die Reparatur, vorrangig von oxidativen DNA-Schäden, in humanen Lymphozyten. Dabei sollte ebenfalls überprüft werden, inwiefern eine Aktivierung dieser Immunzellen, die u.a. zu einer Initiierung der Proliferation führt, modulierend auf die DNA-Reparatur wirkt. Für diese Untersuchungen wurden primäre Lymphozyten aus Buffy Coats isoliert. Eine Aktivierung von T Lymphozyten, welche physiologisch Antigen-vermittelt über den T-Zell-Rezeptor verläuft, wurde durch eine ex vivo Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) nachgeahmt. Die Induktion oxidativer DNA-Basenmodifikationen erfolgte mit Hilfe des Photosensibilisators Acridinorange in Kombination mit sichtbarem Licht. Das Schadensausmaß sowie die Reparatur wurden mittels der Alkalischen Elution unter Nutzung der Reparaturendonuklease Fpg bestimmt.\r\nDie Ergebnisse zeigten, dass global keine Reparatur induzierter oxidativer DNA-Schäden in primären Lymphozyten stattfindet. Eine Aktivierung der Lymphozyten mittels PHA führte hingegen zu einer deutlichen Reduktion der induzierten DNA-Schäden innerhalb einer 24-stündigen Reparaturzeit. Diese verbesserte Reparatur konnte auf eine Steigerung der Transkription und somit eine erhöhte Proteinmenge von OGG1, welches die Reparatur von 8-oxoG DNA-Glykosylase initiiert, zurückgeführt werden. Weiterführende mechanistische Untersuchungen deuten darauf hin, dass der transkriptionellen Regulation von OGG1 eine Aktivierung der JNK-Signalkaskade zugrunde liegt. Als ein verantwortlicher Transkriptionsfaktor konnte NF-YA identifiziert werden. Dessen erhöhte Bindung am OGG1-Promotor in Folge einer PHA-Stimulation konnte durch eine JNK-Hemmung reduziert werden.\r\nDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Aktivierung von Lymphozyten, welche die Proliferation initiiert und dadurch mit dem Risiko für die Entstehung von Mutationen und malignen Entartungen verknüpft ist, gleichzeitig eine transkriptionelle Hochregulation von OGG1 bewirkt, die die Reparatur oxidativer DNA-Schäden sicherstellt. Die Fähigkeit zur Steigerung der DNA-Reparatur unter den gezeigten Bedingungen bietet den proliferierenden Zellen einen Schutzmechanismus zur Erhaltung ihrer genomischen Stabilität.\r\n Oxidative DNA modifications such as 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) are generated continuously in all cells by different agents of endogenous and exogenous origin. Without an effective repair, DNA damage can cause mutations and thus initiate carcinogenesis. Aim of this study was to investigate the repair mechanisms of - in particular oxidatively generated - DNA modifications in humane lymphocytes. Moreover, the influence of an activation of these immune cells, which stimulates proliferation, on DNA repair was to be investigated.\r\nFor these studies primary lymphocytes were isolated from buffy coats. To mimic the activation of T-lymphocytes, which is mediated physiologically via antigens through T-cell receptors, an ex vivo stimulation by phytohämagglutinin (PHA) was utilized. Oxidative DNA modifications were induced by the photosensitizer acridine orange in combination with visible light. The extent of damage and repair rates were determined by the alkaline elution technique in combination with the repair endonuclease Fpg, which recognizes oxidized purines in DNA.\r\nResults showed that there is no repair of induced oxidative DNA base modifications in primary lymphocytes on a global level. However, an activation of lymphocytes by PHA leads to a significant reduction of the number of oxidatively generated purine modifications detected after 24 hours of repair time. The observed improvement of repair was shown to result from an increased transcription and therefore an increased amount of OGG1 protein, which is the repair glycosylase initiating the repair of 8-oxoG. Further studies suggested that the transcriptional regulation of OGG1 under conditions of PHA stimulation results from an activation of the JNK signaling cascade as the underlying mechanism. In this context, the involvement of the transcription factor NF-YA could be verified: an increased binding of NF-YA to the OGG1 promoter as a result of PHA stimulation could be reduced by JNK inhibition.\r\n\r\nThe results of this study show that the activation of lymphocytes, which initiates proliferation and therefore is linked to a higher risk for the development of mutations, results in a transcriptional up-regulation of OGG1 and thereby a more efficient repair of oxidative DNA damage. The ability to accelerate DNA repair under certain conditions provides proliferating cells with a protective mechanism to maintain their genomic stability.\r\n
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4266
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-37690
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	148 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen