Authors:	Tomcin, Stephanie
Title:	Analyse der intrazellulären Freisetzung von Wirkstoffmodellen via konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie
Online publication date:	11-Jun-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie man das Potential nanopartikulärer Systeme, die vorwiegend via Miniemulsion hergestellt wurden, im Hinblick auf â Drug Deliveryâ ausnutzen könnte, indem ein Wirkstoffmodell auf unterschiedliche Art und Weise intrazellulär freigesetzt wurde. Dies wurde hauptsächlich mittels konfokaler Laser-Raster-Mikrokopie (CLSM) in Kombination mit dem Bildbearbeitungsprogramm Volocity® analysiert.rnPBCA-Nanokapseln eigneten sich besonders, um hydrophile Substanzen wie etwa Oligonukleotide zu verkapseln und sie so auf ihrem Transportweg in die Zellen vor einem etwaigen Abbau zu schützen. Es konnte eine Freisetzung der Oligonukleotide in den Zellen aufgrund der elektrostatischen Anziehung des mitochondrialen Membranpotentials nachgewiesen werden. Dabei war die Kombination aus Oligonukleotid und angebundenem Cyanin-Farbstoff (Cy5) an der 5â -Position der Oligonukleotid-Sequenz ausschlaggebend. Durch quantitative Analysen mittels Volocity® konnte die vollständige Kolokalisation der freigesetzten Oligonukleotide an Mitochondrien bewiesen werden, was anhand der Kolokalisationskoeffizienten â Mandersâ Coefficientsâ M1 und M2 diskutiert wurde. Es konnte ebenfalls aufgrund von FRET-Studien doppelt markierter Oligos gezeigt werden, dass die Oligonukleotide weder beim Transport noch bei der Freisetzung abgebaut wurden. Außerdem wurde aufgeklärt, dass nur der Inhalt der Nanokapseln, d. h. die Oligonukleotide, an Mitochondrien akkumulierte, das Kapselmaterial selbst jedoch in anderen intrazellulären Bereichen aufzufinden war. Eine Kombination aus Cyanin-Farbstoffen wie Cy5 mit einer Nukleotidsequenz oder einem Wirkstoff könnte also die Basis für einen gezielten Wirkstofftransport zu Mitochondrien liefern bzw. die Grundlage schaffen, eine Freisetzung aus Kapseln ins Zytoplasma zu gewährleisten.rnDer vielseitige Einsatz der Miniemulsion gestattete es, nicht nur Kapseln sondern auch Nanopartikel herzustellen, in welchen hydrophobe Substanzen im Partikelkern eingeschlossen werden konnten. Diese auf hydrophobe Wechselwirkungen beruhende â Verkapselungâ eines Wirkstoffmodells, in diesem Fall PMI, wurde bei PDLLA- bzw. PS-Nanopartikeln ausgenutzt, welche durch ein HPMA-basiertes Block-Copolymer stabilisiert wurden. Dabei konnte gezeigt werden, dass das hydrophobe Wirkstoffmodell PMI innerhalb kürzester Zeit in die Zellen freigesetzt wurde und sich in sogenannte â Lipid Dropletsâ einlagerte, ohne dass die Nanopartikel selbst aufgenommen werden mussten. Daneben war ein intrazelluläres Ablösen des stabilisierenden Block-Copolymers zu verzeichnen, welches rn8 h nach Partikelaufnahme erfolgte und ebenfalls durch Analysen mittels Volocity® untermauert wurde. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die eigentliche Partikelaufnahme oder die Freisetzung des Wirkstoffmodells. Ein großer Vorteil in der Verwendung des HPMA-basierten Block-Copolymers liegt darin begründet, dass auf zeitaufwendige Waschschritte wie etwa Dialyse nach der Partikelherstellung verzichtet werden konnte, da P(HPMA) ein biokompatibles Polymer ist. Auf der anderen Seite hat man aufgrund der Syntheseroute dieses Block-Copolymers vielfältige Möglichkeiten, Funktionalitäten wie etwa Fluoreszenzmarker einzubringen. Eine kovalente Anbindung eines Wirkstoffs ist ebenfalls denkbar, welcher intrazellulär z. B. aufgrund von enzymatischen Abbauprozessen langsam freigesetzt werden könnte. Somit bietet sich die Möglichkeit mit Nanopartikeln, die durch HPMA-basierte Block-Copolymere stabilisiert wurden, gleichzeitig zwei unterschiedliche Wirkstoffe in die Zellen zu bringen, wobei der eine schnell und der zweite über einen längeren Zeitraum hinweg (kontrolliert) freigesetzt werden könnte.rnNeben Nanokapseln sowie â partikeln, die durch inverse bzw. direkte Miniemulsion dargestellt wurden, sind auch Nanohydrogelpartikel untersucht worden, die sich aufgrund von Selbstorganisation eines amphiphilen Bock-Copolymers bildeten. Diese Nanohydrogelpartikel dienten der Komplexierung von siRNA und wurden hinsichtlich ihrer Anreicherung in Lysosomen untersucht. Aufgrund der Knockdown-Studien von Lutz Nuhn konnte ein Unterschied in der Knockdown-Effizienz festgestellt werden, je nach dem, ob 100 nm oder 40 nm große Nanohydrogelpartikel verwendet wurden. Es sollte festgestellt werden, ob eine größenbedingte, unterschiedlich schnelle Anreicherung dieser beiden Partikel in Lysosomen erfolgte, was die unterschiedliche Knockdown-Effizienz erklären könnte. CLSM-Studien und quantitative Kolokalisationsstudien gaben einen ersten Hinweis auf diese Größenabhängigkeit. rnBei allen verwendeten nanopartikulären Systemen konnte eine Freisetzung ihres Inhalts gezeigt werden. Somit bieten sie ein großes Potential als Wirkstoffträger für biomedizinische Anwendungen.rn During this PhD thesis nanoparticulate systems (mainly obtained via miniemulsion process) were investigated in terms of their potential application as drug delivery systems for biomedical applications. Therefore different possibilities of drug release were analyzed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) in combination with an image processing program called Volocity®.rnPBCA nanocapsules are perfectly suitable for encapsulation of hydrophilic substances like oligonucleotides preventing their degradation during their transport into cells. An intracellular degradation could also be avoided, which was shown by FRET measurements of double labeled oligonucleotides outside and inside cells. An intracellular release based on the electrostatic interaction of the mitochondrial membrane potential and the Cy5-labeled oligonucleotide was demonstrated by measurements with the uncoupler DNP. The special combination of a cyanine-dye labeling an oligonucleotide in 5â -position was found to be crucial for those, previously mentioned interactions. Quantitative analysis with Volocity® brought evidence that all released oligonucleotides accumulated on mitochondria, which was indicated by the colocalization coefficients M1 and M2. Furthermore it was demonstrated that capsulesâ material remained in other intracellular compartments than their released payload. It can be summarized that a combination of cyanine-dye like Cy5 and a sequence of nucleotides or also a drug offers an opportunity to deliver these payloads exclusively to mitochondria.rnThe versatile applicability of the miniemulsion process was utilized not only for the generation of capsules containing a hydrophilic payload but also for the creation of polymeric particles bearing hydrophobic substances inside their polymeric matrix due to hydrophobic interactions. Polystyrene as well as PDLLA nanoparticles were synthesized using the miniemulsion solvent-evaporation technique. The applied HPMA-based block copolymer served as a colloidal stabilizing-agent in the synthesis process and replaced the commonly used surfactant SDS. PMI was â incorporatedâ inside the polymeric particles during the particle formation procedure and represents a model system for hydrophobic drugs. The generated nanoparticles could be used without further purification in uptake studies due to the non-cytotoxic behavior of the surface-active block copolymers, which is of advantage in comparison to SDS-stabilized particles. Applying the polymer nanoparticle in cell experiments, it occurred that PMI was released very fast into cells and accumulated in so called â lipid dropletsâ , even before the actual cellular uptake of nanoparticles. Further studies with double labeled nanoparticles showed an intracellular detachment of the HPMA-based block copolymer 8 h after particle uptake. An independent detection of both, the particlesâ core and the stabilizing block copolymer was ensured by labeling both with a covalently bound fluorophore. These findings were also supported by image analysis with Volocity®. In general it would be possible to incorporate two different drugs in a nanoparticle. One in the hydrophobic core which will be released fast, and one covalently bound to the stabilizing block copolymer which will show a (controlled) release over a longer time after enzymatic degradation, for instance.rnBesides dealing with nanocapsules and nanoparticle prepared by inverse or direct miniemulsion methods also nanohydrogel particles which were obtained by self assembly of an amphiphilic block copolymer were investigated with regard to their uptake behavior and accumulation in lysosomes. The particles were able to enrich their core with siRNA based on electrostatic attraction forces. Due to knock down studies performed by Lutz Nuhn, a difference in the knock down efficiency was found which seemed to be particle size dependent. Kinetic studies of the particle uptake in HeLa were conducted to elucidate whether there is a relation between the particle size and the accumulation of particles in lysosomes. Such accumulation may be responsible for the degradation of siRNA which influences the knock down. Therefore, nanohydrogel particles with a size of 100 and 40 nm respectively were applied in cell experiments investigating their uptake by CLSM. Those CLSM-images gave a hint that there is indeed a faster enrichment of bigger particles in lysosomes in comparison to smaller ones, so that the absence of knock down might be explained by a faster degradation of siRNA which was incorporated in bigger particles. rnEvery nanoparticulate system investigated in this work showed a release of cargo. Thus, these systems have a high potential for their application as drug delivery systems.rn
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4263
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-37660
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	141 S.
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