Authors:	Fink, Annette
Title:	Molekulare Grundlagen der Immunkontrolle des murinen Cytomegalovirus in Gegenwart viruskodierter Immunevasine
Online publication date:	2-Apr-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Die Kontrolle der Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird primär durch antivirale CD8 T-Zellen vermittelt. Während der Koevolution zwischen Virus und Wirt wurden Immunevasionsmechanismen entwickelt, die direkt die Expression der Peptid-MHC-Klasse-I-Komplexe an der Zelloberfläche beeinflussen und es dem Virus ermöglichen, der Immunkontrolle des Wirtes zu entkommen. Da HCMV und das murine CMV (mCMV) zum Teil analoge Strategien zur Modulation des MHC-Klasse-I-Antigen-Präsentationswegs entwickelt haben, wurde in der vorliegenden Arbeit auf das experimentelle Modell mit mCMV zurückgegriffen. Die für die Immunevasion verantwortlichen Genprodukte m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 werden aufgrund ihres regulatorischen Einflusses auf die Antigenpräsentation als vRAPs (viral regulators of antigen presentation) bezeichnet. Diese interferieren mit dem Transport Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Moleküle und reduzieren in ihrer konzertierten Wirkung die Präsentation viraler Peptide an der Zelloberfläche.rnDie Transplantation hämatopoietischer Zellen nach Immunoablation stellt eine etablierte Therapieform bei malignen hämatologischen Erkrankungen dar. Zwischen Immunoablation und der Rekonstitution des Immunsystems sind die Empfänger der transferierten Zellen stark immunsupprimiert und anfällig für eine CMV-Erkrankung bei Reaktivierung des Virus. Neben der Gabe antiviraler Medikamente ist der adoptive Transfer antiviraler CD8 T-Zellen eine vielversprechende Therapiemöglichkeit, um reaktivierende CMV zu kontrollieren, bis das körpereigene Immunsystem wieder funktionsfähig ist. Obwohl im murinen Modell sehr wohl etabliert, stellen im humanen System die eingeschränkte Wirkung und die Notwendigkeit der konsequenten Gabe hoher Zellzahlen gewisse logistische Schwierigkeiten dar, welche die Methode bisher von der klinischen Routine ausschließen.rnDas murine Modell sagte eine Rolle von IFN-γ voraus, da Depletion dieses Zytokins zu einer verminderten Schutzwirkung gegen die mCMV-Infektion führt.rnIm ersten Teil dieser Arbeit sollte ein möglicher inhibitorischer Effekt von m04 auf m152 untersucht werden, der bei der Rekombinanten Î m06W beobachtet wurde. Mit neu generierten Viren (Î m06L1+2) konnte dieser Effekt allerdings nicht bestätigt werden. Bei Î m06W fehlte jedoch eine höher N-glykosylierte Isoform des m152-Proteins. Um zu untersuchen, ob die N-Glykosylierung von m152 für seine Funktion notwendig ist, wurde ein rekombinantes Virus generiert, das in Folge einer Deletion aller 3 N-Glykosylierungssequenzen nur eine nicht-glykosylierte Isoform des m152-Proteins bilden kann. In Übereinstimmung mit der zwischenzeitlich publizierten Kristallstruktur das Komplexes von m152 und dem Liganden RAE-1 des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D konnte erstmals gezeigt werden, dass die Funktionen von m152 in der adaptiven und in der angeborenen Immunität auch von der nicht N-glykosylierten Isoform wahrgenommen werden können.rnIm zweiten Teil der Arbeit sollte mit Hilfe eines Sets an vRAP Deletionsmutanten der Einfluss von IFN γ auf die einzeln oder in Kombination exprimierten vRAPs untersucht werden. Es zeigte sich, dass Vorbehandlung der Zellen mit IFN-γ die Antigenprozessierung nach Infektion stark erhöht und die vRAPs dann nicht mehr in der Lage sind, die Präsentation aller Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Komplexe zu verhindern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass vorher nicht-schützende CD8 T-Zellen Schutz vermitteln können, wenn das Gewebe der Rezipienten konstitutiv mit IFN-γ versorgt wird. Die zusätzliche Gabe von IFN-γ stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, den adoptiven Transfer als Therapie in der klinischen Routine einzusetzen. Infection with human cytomegalovirus (HCMV) is primarily controlled by virus specific CD8 T cells. During virus-host co-evolution CMV has developed strategies of immune evasion in order to subvert immune control by CD8 T cells. As HCMV and its murine equivalent (mCMV) developed analogous strategies for modulation of the MHC class I pathway, the experimental mCMV model has been used in this study. mCMV encodes three viral regulators of antigen presentation (vRAPs): m04/gp34, m06/gp48 and m152/gp40; vRAPs obstruct the transport of peptide-loaded MHC molecules to the cell surface and downmodulate MHC class I surface expression in a cooperative fashion.rnHematopoietic cell transplantation (HCT) following hematoablation is an established alternative therapy for certain types of hematopoietic malignancies. In the transient phase between hematoablation and reconstitution of the immune system HCT recipients are severely immunocompromised, and are therefore at high risk for CMV disease in case of virus reactivation. Besides treatment with antivirals, exogenous reconstitution of virus-specific immune cells by cell transfer, of CD8 T cells in particular, is a promising therapy option to control reactivated CMV infection in HCT recipients prior to endogenous reconstitution of antiviral immunity. Despite recent progress in developing CD8 T-cell-based immunotherapy and promising results in preclinical studies in the murine model, limited efficacy and the consequent requirement of high cell numbers pose logistical problems that have so far prevented this therapy from becoming clinical routine.rnThe murine model predicted a role for interferon (IFN)-γ, because in vivo depletion of this cytokine abolished control of infection by CD8 T cells.rnIn the first part of this work, a presumed inhibitory effect of m04 against the function of m152 should be investigated. This effect was seen after infection with recombinant virus Î m06W. Newly generated viruses (Î m06L1+2) did not confirm this effect, but it was shown that in cells infected with Î m06W a higher glycosylated isoform of m152 is missing. To test if N-glycosylation is essential for m152 function, a recombinant virus was generated in which mutation of all three N-glycosylation sites allowed only the expression of the unglycosylated isoform. In accordance with the meanwhile published crystal structure of the complex between m152 and ligand RAE-1 of the activatory NK cell receptor NKG2D, it could here be shown that the unglycosylated isoform of m152 is sufficient for mediating innate and adaptive immune evasion.rnUsing a set of vRAP-deletion mutants, the effect of IFN-γ on vRAP function was investigated in the second part of this work. It could be shown that pretreatment of cells with IFN-γ enhances antigen-processing and thus generates higher numbers of pMHC-I complexes that exhaust the inhibitory capacity of vRAPs. Pre-conditioning of tissue with IFN-γ renders otherwise non-protective CD8 T cells into cells protective against CMV disease upon adoptive transfer.rnThe results of this work predict that pre-conditioning of patients with a short-term IFN-γ therapy preceding HCT enhances the efficacy of preemptive CD8 T-cell therapy of CMV infection and disease.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4221
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-37087
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	153 Bl.
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