Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4216
Authors: Mathäs, Marianne
Title: Unmittelbare, dauerhafte sowie evolutionäre Anpassung an Fremdstoffexpositionen
Online publication date: 25-Mar-2014
Language: german
Abstract: Eine der Hauptursachen für unerwünschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprünglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schädlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfähigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Säugetieren werden Fremdstoffe hauptsächlich von den nukleären Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dünndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche über PXR und CAR wirken, gehören unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zählen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten über Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. \\r\\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschränkt sein, um Störungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsübergreifende Effekte von Medikamenten in Mäusen geliefert. Nachkommen von Müttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefähr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsänderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab außerdem dauerhafte Expressionsveränderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \\r\\nBerücksichtigt man die enge evolutionäre Verwandtschaft der nukleären Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitveränderungen auch für PXR möglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab für Mäuse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verändert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Müttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomöostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darüber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \\r\\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshäufigkeit wesentlich öfter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsänderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verändert exprimieren und die Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nächste Generation übertrugen. \\r\\n\\r\\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsübergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anstöße dafür, dass dies in Zukunft für viel mehr Medikamente notwendig werden könnte. Neben Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Störungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verständnis der Rezeptoraktivität von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivität würde wichtige Beiträge zum Verständnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Veränderungen endogener Stoffwechselwege könnten dann möglicherweise über eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivität reduziert werden. \\r\\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermöglichen ein besseres Verständnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben Ähnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Säugetiere: eine niedrige basale Aktivität sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivität des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivität war nicht abhängig von der subzellulären Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. Ähnlich dem PXR der Säugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomäne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosäuren zum jeweils humanen Homolog erhöhten die basale Aktivität des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhöhter basalen Aktivität zeigten eine verstärkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien überlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.
A major source of adverse drug reactions is the induction of drug-metabolizing enzymes and transporters. This induction originally constitutes a physiological response to potentially harmful xenobiotics and it is essential to health and reproduction. In humans and other mammals xenobiotics are detected chiefly by the nuclear receptors PXR and CAR expressed in the liver and small intestine. Drugs acting via PXR and CAR include anticonvulsants, statins, antiretrovirals, glucocorticoids as well as antimycotics. The xenobiotic-activated transcription factors PXR and CAR induce the expression of xenobiotic-metabolizing enzymes and transporters. Most notable examples are the broad-spectrum cytochrome P450-enzymes (Cyp-enzymes) or the transporter MDR1, which transports various substrates across membranes. Enzymatic biotransformation increases the solubility of xenobiotics, facilitating their excretion with the urine or bile. \\r\\nThe induction is assumed to be contingent upon the presence of an inducer to reduce disturbances of endogenous pathways. In contrast, this work indicates that inducing drug effects can be transmitted across generations. Offspring of female F0-mice injected as newborns with TCPOBOP, a murine CAR ligand, showed an approximately 100-fold gene-induction of Cyp2b10. There were also altered expressions of genes with products involved in the lipid metabolism and immunological diseases. High throughput sequencing of the injected parental generation revealed additionally long-term expression changes of other genes related to drug metabolism and energy metabolism. Considering the close evolutionary relationship between the nuclear receptors CAR and PXR, the existence of long-term changes triggered by PXR-activation was also likely and was investigated alongside. High throughput sequencing of mice induced with the PXR-activator PCN revealed expression changes implicated in liver necrosis 3 month after exposition. In offspring of PCN-injected females gene-expression changes related to energy homeostasis as well as the glucose metabolism were observed. Adult offspring displayed differential expression of genes with products involved in the immune response.\\r\\nAdults are exposed to xenobiotics more often due to the age-driven increase in the disease prevalence. Therefore it was of particular medical interest if long-term gene expression changes could be observed in adults, too. This work demonstrates that transiently induced adult animals also show long-term modified gene expression levels and that they transmit an altered drug metabolism to the next generation.\\r\\nSo far clinical trials for the risk-assessment of drugs (pharmacovigilance) are not designed to detect such multigenerational effects. This work suggests that such effects will have to be considered in future drug trails. In addition to changes in drug metabolism, adverse drug effects of CAR- and PXR-ligands may result from their involvement in endogenous metabolic pathways. For instance, activation of CAR, which regulates numerous metabolic pathways, results in disturbances of energy metabolism. A deeper understanding of the CAR-receptor activity would significantly contribute to the knowledge of the regulation of the drug metabolism as well as the origin of adverse side effects in therapies with CAR-ligands. In the future, long-term changes of endogenous metabolic pathways could be reduced by pharmacologic modulation of CAR-activity.\\r\\nTo draw comparisons between species will allow a better knowledge of human proteins. For this purpose, CAR-receptors of amphibians (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) and reptiles (Anolis carolinensis) were cloned for the first time, expressed as proteins and characterized. Comparisons between species allow for a better understanding of human proteins. Functional analysis revealed similarities of Xenopus laevis-CAR with mammalian PXR: a low basal activity as well as a pronounced inducibility by ligands. The determinants of the Xenopus laevis-CAR basal activity were investigated in functional assays. The basal activity was independent from the subcellular localization of the receptor, but related to its protein structure, which, in contrast to land vertebrates, is fixed in an inactive conformation. Similar to mammalian PXR, the activation domain of the amphibian CAR is brought into an active conformation only upon ligand binding. Mutation of single amino acids to the corresponding human homolog elevated the basal activity of Xenopus laevis-CAR to the level of the human receptors. The mutants with increased basal activity showed enhanced interaction with the cofactor PGC-1a, a regulator of the energy metabolism in mammals. The hepatic target genes of amphibian CAR partly overlap with human target genes and play a role in energy metabolism, too.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4216
URN: urn:nbn:de:hebis:77-37013
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 108 S.
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
3701.pdf3.91 MBAdobe PDFView/Open