Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4204
Authors: Buckel, Iris
Title: Beschreibung von phytotoxischen Dioxolanonen als konstitutive Virulenzfaktoren und Etablierung eines Transformationssystems zur zielgerichteten Mutagenese in Guignardia bidwellii
Online publication date: 12-Jan-2016
Language: german
Abstract: Bedingt durch den Klimawandel kommt es vermehrt zum Auftreten neuer, meist invasiver Schaderreger, vor allem auch in bislang nicht beeinträchtigten Gebieten. Ein Beispiel ist der rebenpathogene Pilz Guignardia bidwellii, der die Schwarzfäule an Reben verursacht. Seit 2002 kann er sich bedingt durch veränderte Umweltbedingungen in deutschen Weinbaugebieten etablieren und zu großen wirtschaftlichen Schäden führen. Aufgrund vermehrt auftretender Resistenzen gegenüber synthetischen Fungiziden steigt der Bedarf nach neuen Bekämpfungsstrategien, deren Entwicklung ein tiefgehendes Verständnis der Pathogen-Wirt-Interaktion voraussetzt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Bedeutung der von G. bidwellii produzierten phytotoxischen Dioxolanone für den Infektionsprozess und eine Beschreibung der niedermolekularen Verbindungen als Virulenzfaktoren herausgearbeitet werden. Erstmalig wurde das phytotoxische Dioxolanon Guignardic acid in planta aus G. bidwellii-infizierten Weinblättern identifiziert, womit eine Produktion des Toxins während des invasiven Wachstums des Pathogens in der Pflanze bewiesen wurde. Zusätzlich konnte durch Untersuchungen an weiteren phytopathogenen Arten der Gattung Guignardia die Bedeutsamkeit dieser Sekundärmetabolite für den Infektionsprozess von G. bidwellii bestätigt werden. Alle untersuchten Arten verursachen eine ähnliche Symptomatik an ihren Wirtspflanzen wie G. bidwellii an Wein und produzieren unter Laborbedingungen in Submersfermentationen ebenfalls die aus G. bidwellii bekannten phytotoxischen Dioxolanone. Aufgrund der Bedeutung der Naturstoffe für den Infektionsprozess wurde im weiteren Verlauf der Arbeit die Biosynthese der Verbindungen untersucht. Da die Verbindungen einer neuen Naturstoffklasse angehören, ist über deren Synthese noch nichts bekannt. Durch Markierungsversuche mit 13C-Phenylalanin konnte nachgewiesen werden, dass die Aminosäure Phenylalanin das Ausgangssubstrat zur Synthese der phytotoxischen Dioxolanone ist. Diese entscheidenden Erkenntnisse in der Biosynthese der phytotoxischen Dioxolanone führten zum zweiten Teil dieser Arbeit, in dem eine toxinfreie Mutante von G. bidwellii generiert werden sollte. Zu Beginn dieser Arbeit war das Genom von G. bidwellii nicht sequenziert und es war kein etabliertes Transformationssystem verfügbar. Zunächst wurde das Genom von G. bidwellii sequenziert und ein geeignetes Transformationssystem zur Untersuchung der molekularen Basis von Pathogen-Wirt-Interaktionen ermittelt. Aus dem Genom von G. bidwellii konnten die kodierenden Sequenzen von drei Schlüsselenzymen identifiziert werden, die am Aminosäurestoffwechselweg beteiligt sind, die Aspartat-Transaminase, die Chorismat-Synthase und die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase. Das Transformationssystem mittels Agrobacterium tumefaciens wurde für eine zielgerichtete Mutagenese in G. bidwellii optimiert. Dabei wurden sowohl die zu übertragenden Konstrukte als auch die Parameter der Transformationsmethode direkt modifiziert. Diese Untersuchungen brachten entscheidende Fortschritte in der Etablierung eines Transformationssystems für G. bidwellii zur zielgerichteten Mutagenese. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind eine zuverlässige Basis zur Untersuchung der Pathogen-Wirt-Interaktion zwischen Guignardia bidwellii und Vitis vinifera und können die Entwicklung von neuen Bekämpfungsstrategien und biologicals ermöglichen, die auch im ökologischen Weinbau Anwendung finden können.
Climate changes cause an increasing emergence of new, mostly invasive pests that occur even in areas unaffected up to now. One example is the wine pathogenic fungus Guignardia bidwellii, the causal agent of grape black rot. Since 2002 this pathogen has been established due to the changing environmental conditions in German wine-growing areas and causes major economic damage. Due to the increased resistance to synthetic fungicides, the development of new control strategies is essential. This development depends on a better understanding of the pathogen-host-interaction. In the first part of this research paper the significance of the phytotoxic dioxolanones produced by G. bidwellii for the infection process and a characterisation of theses secondary metabolites as virulence factors has been worked out. The first time the phytotoxic dioxolanone guignardic acid was identified in planta from G. bidwellii infected wine leaves. Therefore a production of the toxin during active growth of the pathogen in the plant was demonstrated. Additionally, the importance of these secondary metabolites for the infection process has been confirmed by the investigation of further phytopathogenic Guignardia species. All studied species cause similar symptoms to their host plants as G. bidwellii do to wine and produce under laboratory conditions in submerged fermentation the same known phytotoxic dioxolanones. As to the importance of these natural products for the infection process their biosynthesis was investigated in the course of this research. Since the compounds belong to a new class of natural products the synthesis is still not yet known. Due to label experiments with 13C-phenylalanine it could be demonstrated that the amino acid phenylalanine is the starting substrate for the biosynthesis of the phytotoxic dioxolanones. These essential findings in the biosynthesis of phytotoxic dioxolanones led to the second part of this research, in which a toxin-free mutant of G. bidwellii should be generated. At the beginning the genome of G. bidwellii was not sequenced and it was no established transformation system available. First the genome was sequenced and an appropriate transformation system was determined to study the molecular basis of pathogen-host-interactions. From the genome of G. bidwellii the coding sequences of three key enzymes have been identified which are involved in the amino acid metabolism. These enzymes are the aspartate transaminase, the chorismate synthase, and the phenylalanine ammonia lyase. The transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens has been optimised for a targeted mutagenesis in G. bidwellii. Therefore both the transferred constructs and the parameters of the method were modified. These studies led to a significant advance in the establishment of a transformation system for G. bidwellii for site-directed mutagenesis. The results of this research are a reliable basis for the investigation of the pathogen-host-interaction between Guignardia bidwellii and Vitis vinifera and may allow the development of new control strategies and biological agents that can also be applied in organic viticulture.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4204
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000000425
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 160 S.
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