Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4165
Authors: Kleefeld, Alexandra
Title: Der Carrier DcuB als zweiter Sensor des Zweikomponentensystems DcuSR in Escherichia coli
Online publication date: 24-Oct-2006
Language: german
Abstract: Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate und andere Carbonsäuren als Substrate für den aeroben und anaeroben Stoffwechsel nutzen. Die Anwesenheit von C4-Dicarboxylaten im Außenmedium wird über das Zweikomponentensystem DcuSR, bestehend aus der membranständigen Sensorkinase DcuS und dem cytoplasmatischen Responseregulator DcuR, erkannt. Die Bindung von C4-Dicarboxylaten an die periplasmatische Domäne von DcuS führt zu einer Induktion der Zielgene. Hierzu zählen die Gene für den anaeroben Fumarat/Succinat-Antiporter DcuB (dcuB), die anaerobe Fumarase (fumB) und die Fumaratreduktase (frdABCD). Unter aeroben Bedingungen stimuliert DcuSR die Expression des dctA Gens, das für den aeroben C4-Dicarboxylat-Carrier DctA kodiert. Für den Carrier DcuB konnte eine regulatorische Funktion bei der Expression der DcuSR-regulierten Gene gezeigt werden. Die Inaktivierung des dcuB Gens führte bereits ohne Fumarat zu einer maximalen Expression einer dcuB´-´lacZ Reportergenfusion und anderer DcuSR-abhängiger Gene. Diese Stimulierung erfolgte nur in einem dcuS-positiven Hintergrund. DcuB unterscheidet sich damit von den alternativen Carriern DcuA und DcuC, die diesen Effekt nicht zeigten. Mithilfe ungerichteter Mutagenese wurden DcuB-Punktmutanten hergestellt (Thr394Ile und Asp398Asn), die eine Geninduktion verursachten, aber eine intakte Transportfunktion besaßen. Dies zeigt, dass der regulatorische Effekt von DcuB unabhängig von dessen Transportfunktion ist. Durch gerichtete Mutagenese wurde die Funktion einer Punktmutation (Thr394) näher charakterisiert. Es werden zwei Modelle zur Membrantopologie von DcuB und der Lage der Punktmutationen im Protein vorgestellt. Da DcuB seine regulatorische Funktion über eine Interaktion mit DcuS vermitteln könnte, wurden mögliche Wechselwirkungen zwischen DcuB und DcuS als auch DcuR mithilfe von Two-Hybrid-Systemen untersucht. Für biochemische Untersuchungen von DcuB wurde außerdem die Expression des Proteins in vivo und in vitro versucht. Unter aeroben Bedingungen beeinflusst der C4-Dicarboxylat-Carrier DctA die Expression der DcuSR-abhängigen Gene. Eine Mutation des dctA Gens bewirkte eine stärkere Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion im Vergleich zum Wildtyp. Diese Expression nahm in einem dcuS-negativen Hintergrund ab, die Succinat-abhängige Induktion blieb jedoch erhalten. Unter anaeroben Bedingungen kann das dctA Gen auch durch Inaktivierung von DcuB induziert werden. Es wird ein Modell vorgestellt, das die Beteiligung beider Carrier an der DcuSR-abhängigen Regulation erklärt.
Escherichia coli is able to use C4-dicarboxylates and other carbon acids as substrates for its aerobic and anaerobic metabolism. C4-dicarboxylates in the media are recognized via the two-component regulatory system DcuSR consisting of the sensory histidine kinase DcuS and the response regulator DcuR. Binding of C4-dicarboxylates to the periplasmic domain of DcuS leads to target gene induction. These genes comprise the gene for the anaerobic fumarate/succinate antiporter DcuB (dcuB), the anaerobic fumarase (fumB) und the fumarate reductase (frdABCD). Under aerobic conditions DcuSR stimulates expression of the dctA gene encoding the aerobic C4-dicarboxylate transporter DctA. The carrier DcuB is involved in regulating expression of DcuSR dependent genes. Inactivation of the dcuB gene leads to full induction of a dcuB´-´lacZ reporter gene fusion and other DcuSR regulated genes. This stimulation can only be observed in a dcuS positive strain. Therefore, DcuB function differs from the alternative transporters DcuA and DcuC that do not influence gene expression. Two point mutations in DcuB (Thr394Ile and Asp398Asn) could be identified by using undirected mutagenesis, that lead to the same induction of target gene expression without altering transport. Thus, the regulatory function of DcuB is independent from transport. The function of Thr394 was further characterized by site-directed mutagenesis. Two models on DcuB membrane topology and the localization of the regulatory amino residues in the secondary structure are introduced. Potential regulatory interactions between DcuB, DcuS and DcuR were investigated using bacterial two-hybrid systems. For biochemical research in vivo and in vitro overexpression of the DcuB protein was tested. Under aerobic conditions expression of DcuSR regulated genes is influenced by the C4-dicarboxylate carrier DctA. Deletion of dctA induces expression of a dctA´-´lacZ reporter gene fusion in comparison to the wild type. The expression decreased in a dcuS negative background, but was still dependent on succinate. Under anaerobic conditions induction of dctA can be achieved by inactivation of dcuB. A model is introduced which explains the involvement of both carriers in gene regulation via the DcuSR system.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4165
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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