Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4161
Authors: Boisguerin, Valesca
Title: Recombinant expression of molluscan hemocyanin (KLH) substructures in a prokaryotic system: E. coli
Online publication date: 17-Oct-2006
Language: english
Abstract: The recombinant expression of 19 different substructures of KLH in the prokaryotic sys-tem E. coli has been successfully achieved: each one of the eight single FUs a to h of both isoforms, KLH1 and KLH2, two substructures consisting of two consecutive FUs (KLH1-bc and KLH1-gh) as well as a cDNA encompassing KLH1-abc. All recombinant proteins, fused to an N-terminal 6xHis tag, have successfully been detected by immuno precipitation using monoclonal α-His-antibodies and polyclonal α-KLH1- and α-KLH2-antibodies. One exception remained: SP-KLH2-a, which was not detected by the α-His-antibodies. This allows speculations as to whether the coexpressed signal peptide can lead, at one hand, to the secretion of the recombinant protein, and on the other to the simultaneous cut-off of the leader peptide, which results in the splitting off of even more N-terminal 6xHis tag, leading to failed recognition by the appropriate antibodies. The comparison of native KLH with recombinantly expressed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (Sf9 insect cells) KLH was done using FU-1h. The weak detection by the polyclonal α-KLH1- antibodies of both recombinantly expressed proteins showed that the native protein was the best recognized. For the prokaryotic one, both the denaturation applied for solubilisation of the bacterial inclusion bodies and the inability of bacterial cells to add N-linked glycosylation, are the reason for the poor hybridization. In contrast, KLH1-h expressed in eukaryotic insect cells is likely to be glycosylated. The incubation with the α-KLH1-antibodies resulting in the same weak detection, however, revealed that the linked carbohydrate side chains are not those expected. The establishment of SOE-PCR, together with further improvement, has enabled the generation of a clone encompassing the complete subunit KLH1-abcdefgh. The se-quence analysis compared to the original KLH1 sequence showed, however, that the resulting recombinant protein is defective in two histidines, required for the copper bind-ing sites in FU-1b and FU-1d and in three disulfide bridges (FU-1a, FU-1b and FU 1g). This is due to polymerase- related nucleotide exchanges, resulting in a changed amino acid sequence. Nevertheless, all eight potential N-glycosylation sites are present, leading to the speculation that the recombinant protein can in theory be fully glycosylated, which is the most important aspect for the clinical applicability of recombinant KLH as an im-munotherapeutic agent. The improvement of this method elaborated during the present work indicates bright prospects for the future generation of a correct cDNA sequence encoding for the complete KLH2 subunit.
Die rekombinante Expression von 19 verschiedenen KLH-Teilstrukturen ist in dem pro-karyotischen System E. coli erfolgreich durchgeführt worden: jede einzelne der acht funktionellen Domänen a bis h beider Isoformen, KLH1 und KLH2, zwei Teilstrukturen bestehend aus zwei funktionellen Domänen (KLH1-bc und KLH1-gh) sowie der für KLH1-abc kodierenden cDNA. Alle rekombinanten Proteine konnten durch spezifische α-KLH1- und α-KLH2-Antikörper, und aufgrund des coexprimierten N-terminalen 6x-His-tags auch durch spezifische α-His-Antikörper, nachgewiesen werden. Eine Ausnah-me bildet SP-KLH1-a, welches nicht durch den α-His-Antikörper nachgewiesen werden konnte. Die Coexpression des Signalpeptids könnte zum Einen dazu führen, dass das rekombinante Protein sekretiert wird, oder zum Anderen, dass es abgespalten wird, so dass das noch weiter N-terminal gelegene 6x-His-tag mit abgespalten wird, so dass keine Detektion durch den α-His-Antikörper stattfinden kann. Der Vergleich des nativen KLH mit dem rekombinant exprimierten prokaryotischen (E. coli) und eukaryotischen (Sf9 Insektenzellen) KLH wurde mit FU-1h durchgeführt. Bei-de rekombinanten Proteine werden durch den α-KLH1-Antikörper deutlich schwächer erkannt als die native Form des Proteins. Die Denaturierung zur Lösung der bakteriellen inclusion bodies und die fehlenden N-gebundenen Glykosylierungen könnten beim pro-karyotischen Protein die Gründe dafür sein. Das eukaryotisch exprimierte KLH1-h ist wahrscheinlich glykosyliert, die schwache Antikörpererkennung lässt allerdings darauf schließen, dass es nicht die richtigen Zuckerketten sind. Die Etablierung der SOE-PCR ermöglichte die Herstellung eines Klons, der für die ge-samte KLH1-Untereinheit kodiert. Der Vergleich mit der Originalsequenz zeigt jedoch, dass dem daraus resultierenden rekombinanten Protein durch polymerasebedingte Nukleotidaustausche zwei Histidine (FU-1b und FU-1d) und drei Disulfidbrücken (FU-1a, FU-1b und FU-1g) fehlen werden. Alle acht potentiellen N-Glykosylierungsstellen hingegen sind vorhanden, so dass das rekombinante Protein bei korrekter Prozessierung vollständig glykosyliert sein könnte. Dies ist ein wichtiger Aspekt für die spätere klini-sche Anwendung von rekombinantem KLH als immuntherapeutisches Agens. Die wäh-rend dieser Arbeit entwickelte Verbesserung der Methode könnte zu einer korrekten, für die gesamte Untereinheit des KLH2 kodierenden cDNA führen.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4161
URN: urn:nbn:de:hebis:77-11625
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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