Authors:	Kern, Andreas
Title:	Die Prozessierung des humanen Amyloid-Vorläuferproteins im Verlauf der replikativen Seneszenz
Online publication date:	8-Aug-2006
Year of first publication:	2006
Language:	german
Abstract:	Die Alterung stellt den größten Risikofaktor für die Entwicklung der Alzheimer Krankheit dar, wobei die biochemische Basis dieser Korrelation bisher nicht bekannt ist. Ein möglicherweise zentraler Mechanismus der Alzheimer Pathologie wird durch die Prozessierung von APP repräsentiert, die in der Synthese von Aβ resultiert. Der Einfluss zellulärer Alterung auf die Biochemie der APP-Prozessierung ist bislang weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Prozessierung von endogenem APP im Verlauf der Zellalterung humaner Fibroblasten progressiv verringert wird. Die Bildung der intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) nahm mit zunehmender Lebensspanne ab und war gleichfalls mit einer reduzierten Synthese von extrazellulären APP-Fragmenten (sAPP, sAPPα) verbunden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Reifung von APP in seneszenten Zellen selektiv reduziert war, und dass dies durch altersabhängig erhöhte zelluläre Cholesterolspiegel vermittelt wurde. Von den APP-prozessierenden Sekretasen waren die Proteinspiegel von Presenilin-1 und Nicastrin, beides Komponenten der γ-Sekretase, im Verlauf der Zellalterung graduell verringert. Dies hatte einen progressiven Rückgang der enzymatischen Aktivität der γ-Sekretase zur Folge, wodurch die Prozessierung von APP unmittelbar reduziert wurde. Die Proteinspiegel von ADAM10, einer α-Sekretase, sowie der β-Sekretase, BACE, wiesen keine Altersregulation auf, aber interessanterweise wurde eine erhöhte enzymatische Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen nachgewiesen. Die γ-Sekretase sowie BACE sind in Lipid Rafts lokalisiert, geordneten Membransubdomänen, die hohe Cholesterol- und Caveolin-1-Spiegel aufweisen. Obwohl das Gesamtniveau dieser strukturellen Komponenten von Lipid Rafts in seneszenten Zellen erhöht war, war die Assoziation beider Moleküle mit Lipid Rafts reduziert und sie akkumulierten in speziellen Organellen, die höchstwahrscheinlich Lipidkörper darstellen. Somit wurde gezeigt, dass Lipid Rafts im Zuge der Zellalterung disintegrieren beziehungsweise in ihrem Gesamtspiegel reduziert waren. Diese altersabhängige Membranmodifikation war mit einer veränderten Verteilung von Presenilin-1 und BACE zwischen der Lipid Raft und der Nicht Raft Fraktion der Membran verbunden, die möglicherweise das Potential dieser Enzyme zur Prozessierung von APP reduzierte. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden transgene C. elegans konstruiert, die humanes APP exprimieren, das C-terminal an GFP gekoppelt war. Diese Würmer wiesen eine reduzierte Fertilität, Eilegedefekte und eine verzögerte post-embryonale Entwicklung auf, die möglicherweise auf eine Transgen-vermittelte Neurodegeneration zurückgeführt werden können. Durch erste Untersuchungen der Prozessierung des Transgens konnten Spaltfragmente nachgewiesen werden, die potentiell auf eine spezifische Spaltung von APP durch die endogenen Sekretasen schließen lassen. Somit werden die Prozessierung sowie die Reifung von APP durch die altersabhängige Modifikationen zellulärer Biochemie nachhaltig beeinflusst. Zukünftige Studien sollen zeigen, ob sich diese zellulären Zusammenhänge in den Gesamtorganismus C. elegans übertragen lassen. Des Weiteren sollen die altersabhängigen zellulären Veränderungen, insbesondere des Cholesterol-Metabolismus und der Sekretaseaktivitäten, weitergehend analysiert werden, um zusätzliche Erkenntnisse über altersassoziierte Regulationen möglicher therapeutischer Ziele der Alzheimer Erkrankung zu gewinnen. Aging is the most prevailing risk factor for the development of Alzheimer disease, even though the biochemical basis of this correlation is unknown. Processing of APP represents a possible central mechanism of the Alzheimer pathology, which results in the synthesis of Aβ. However, the influence of cellular aging on the biochemistry of APP processing has not been studied in molecular detail so far. In this study, it was shown that processing of endogenous APP is down-regulated during cellular aging of human fibroblasts. Generation of the intracellular APP cleavage products (C99, C83 and AICD) was reduced with increasing life span and was associated by a decreased secretion of soluble extracellular APP fragments (sAPP, sAPPα). Further, the maturation of APP was shown to be reduced in senescent cells, which was directly mediated by age-associated increased levels of cellular cholesterol. Of the APP processing secretases, protein levels of presenilin-1 and nicastrin, constituents of the γ-secretase complex, were gradually reduced during aging. This was associated by a progressive reduction in γ-secretase enzymatic activity, which directly results in a decreased processing of APP. Protein levels of ADAM10, an α-secretase, as well as the β-secretase, BACE, were not regulated during aging, but, interestingly, the β-secretase enzymatic activity was up-regulated in senescent cells. The γ- and β-secretase are located in lipid rafts, well-ordered membrane subdomains exhibiting high levels of cholesterol und caveolin-1. Although total levels of both structural components of lipid rafts were increased in aged cells, their particular lipid raft association was decreased and they accumulated in specialized organelles, which very likely resemble lipid bodies. Thus, lipid rafts were structurally disintegrated or decreased in total levels during cellular aging. This age-dependent membrane modification was associated by an altered distribution of presenilin-1 and BACE between the lipid raft and non-raft fraction of the membrane, which very likely affects their APP processing potential. In a second part of this study, transgenic C. elegans were constructed, which express human APP coupled to GFP. These worms exhibited a reduced fertility, an egg laying defect as well as a delayed post-embryonic development, which potentially can be ascribed to a transgene-mediated neurodegeneration. First studies of the processing of the transgene revealed potentially specific fragments, concluding that human APP is possibly specifically cleaved by the endogenous secretases. Thus, processing and maturation of APP are significantly influenced by age-dependent alterations in cellular biochemistry. Future studies should aim to transfer the results of the cellular aging model into the organism C. elegans. Furthermore, the analysis of age-associated cellular alterations, in particular of the cholesterol metabolism and secretase activity, should provide further insight about age-associated regulations of these possible Alzheimer disease therapeutical targets.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4135
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-11316
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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