Authors:	Debiak, Malgorzata
Title:	Processing of O 6 - methylguanine in mammalian cells
Online publication date:	9-Aug-2006
Year of first publication:	2006
Language:	english
Abstract:	DNA methylating compounds are widely used as anti-cancer chemotherapeutics. The pharmaceutical critical DNA lesion induced by these drugs is O6-methylguanine (O6MeG). O6MeG is highly mutagenic and genotoxic, by triggering apoptosis. Despite the potency of O6MeG to induce cell death, the mechanism of O6MeG induced toxicity is still poorly understood. Comparing the response of mouse fibroblasts wild-type (wt) and deficient for ataxia telangiectasia mutant protein (ATM), a kinase responsible for both the recognition and the signalling of DNA double-strand breaks (DSBs), it was shown that ATM deficient cells are more sensitive to the methylating agents N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), methyl methansulfonate (MMS) and the anti-cancer drug temozolomide, in both colony formation and apoptosis assays. This clearly shows that DSBs are involved in O6MeG toxicity. By inactivating the O6MeG repair enzyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) with the specific inhibitor O6-benzylguanine (O6BG), ATM wt and deficient cells became more sensitive to MNNG and MMS. The opposite effect was observed when over-expressing MGMT in ATM -/- cells. The results show that O6MeG is the critical DNA lesion causing death in ATM cells following MNNG treatment, and is partially responsible for the toxicity observed following MMS treatment. Furthermore, by inhibiting the ATM kinase activity with caffeine, it was shown that the resistance of wt cells to MNNG was due to the kinase activity of ATM, as wt cells underwent more apoptosis following methylating agent treatment in the presence of caffeine. Apoptosis and caspase-3 activation were late events, starting 48h after treatment. This lends support to the model where O6MeG lesions are converted into DSBs during replication. As ATM wt and deficient cells showed similar G2/M blockage and Chk1 activation following MNNG and MMS treatment, it was concluded that the protective effect of ATM is not due to cell cycle progression control. The hypersensitivity of ATM deficient cells was accompanied by their inability to activate the anti-apoptotic NFkB pathway. In a second part of this study, it was shown that the inflammatory cytokine IL-1 up-regulates the DNA repair gene apurinic endonuclease 2 (APEX2). Up-regulation of APEX2 occurred by transcriptional regulation as it was abrogated by actinomycin D. APEX2 mRNA accumulation was accompanied by increase in APEX2 protein level. IL-1 induced APEX2 expression as well as transfection of cells with APEX2 cDNA positively correlated with a decrease in apoptosis after treatment with genotoxic agents, particularly affecting cell death after H2O2. This indicates an involvement of APEX2 in the BER pathway in cells responding to IL-1. DNA-methylierende Agenzien werden verbreitet als anti-Krebs Therapeutika benutzt. Der durch diese Präparate verursachte DNA-Schaden ist die Bildung von O6–Methylguanin (O6MeG). Durch Auslösen von Apoptose ist O6MeG hoch mutagen und genotoxisch. Trotz der Fähigkeit von O6MeG den Zelltod zu induzieren, ist der Mechanismus der durch O6MeG erzeugten Toxizität kaum verstanden. Durch Vergleich von Maus wildtyp (wt) und für Ataxia Telangiectasia Mutant Protein (ATM), einer Kinase, die sowohl für das Erkennen als auch als Signalprotein von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) verantwortlich ist, defiziente Fibroblasten wurde gezeigt, daß ATM-defiziente Zellen sowohl in Colony Formation- als auch in Apoptose-Assays sensitiver gegen die methylierenden Agentien N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), Methyl methansulfonate (MMS) und das anti-Krebs Mittel Temozolomide sind. Dies zeigt klar, daß DSBs an der Toxizität von O6MeG beteiligt sind. Durch Inaktivierung des O6MeG-Reparaturenzyms O6–Methylguanin-DNA methyltransferase (MGMT) mit dem spezifischen Inhibitor O6-Benzylguanin wurden ATM wildtyp und defiziente Zellen sensitiver gegenüber MNNG und MMS. Der entgegengesetzte Effekt wurde beobachtet, wenn MGMT in ATM -/- Zellen überexprimiert wurde. Das Ergebnis zeigt, daß O6MeG der kritische DNA-Schaden ist, der den Tod von ATM-Zellen nach MNNG Behandlung bewirkt, und teilweise die Toxizität nach MMS Behandlung bewirkt. Weiterhin wurde durch Hemmung der ATM Kinase mit Koffein gezeigt, daß die Resistenz von wt Zellen auf der Kinaseaktivität von ATM beruht, da bei Behandlung mit methylierenden Agentien in Gegenwart von Koffein wt Zellen vermehrt Apoptose zeigten. Apoptose und Caspase-3 Aktivierung traten nach 48 h Behandlung auf. Dies unterstützt das Modell, in dem O6MeG-Schäden während der Replikation in DSBs umgewandelt werden. Da ATM wt und defiziente Zellen die gleiche G2/M Blockade und Chk1 Aktivierung nach MNNG und MMS Behandlung zeigten, kann geschlossen werden, daß der schützende Effekt von ATM nicht durch Kontrolle des Fortschritts des Zellzyklusses erfolgt. Die Hypersensivität von ATM defizienten Zellen wurde von der Unfähigkeit den anti-apoptotischen NFkB-Weg zu aktivieren begleitet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde nachgewiesen, daß das inflammatorische Cytokin IL-1 das DNA-Reparaturgen für Apurinische Endonuclease 2 (APEX2) hoch reguliert. Die Hochregulation erfolgt auf Ebene der Transkription, da sie durch Actinomycin D aufgehoben werden konnte. Die Akkumulation von APEX2-mRNA ging einher mit einem Anstieg von APEX2-Protein. IL-1 induziert die APEX2-Expression, die Transfektion von Zellen mit APEX2-cDNA war positiv korreliert mit einer Abnahme der Apoptose nach Behandlung mit genotoxischen Agentien.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4129
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-11221
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen