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Authors: Yemelin, Alexander
Title: Identification and characterization of novel factors involved in dimorphism and pathogenicity of fungal wheat pathogen Zymoseptoria tritici
Online publication date: 20-Dec-2017
Language: english
Abstract: In the current study Zymoseptoria tritici (teleomorph: Mycosphaerella graminicola) was used as a model organism, representing one of the most economically important fungal pathogens worldwide. This fungus causes Septoria blotch disease on wheat plants, responsible for massive crop losses every year. One of the characteristic features of this fungus is its ability to switch between two distinct growth forms, which can be induced by different environmental conditions. The fungus differentiates a yeast-like growth form, which is observed on nutrient-rich culture media. On the other hand, the fungus propagates in filamentous growth form, which is induced by nutrient deprivation or elevated temperature. The latter form is associated with pathogenicity, allowing the fungus to infect and colonize the host plant. A forward genetics approach was applied, aiming to investigate the molecular basis of the morphological transition of the wheat pathogenic fungus Z. tritici. A previously developed Agrobacterium tumefaciens mediated transformation protocol was used to generate a mutant library by insertional mutagenesis including more than 10000 random insertional transformants. A plate-based screening system was established, to identify mutant strains harbouring defects in dimorphic transition. Hence, with this approach eleven dimorphic switch deficient random mutants were recovered, ten of which exhibited a yeast-like mode of growth and one mutant predominantly growing filamentously, producing a high amount of mycelium under different incubation conditions. Sequence analysis of flanking regions for T-DNA insertions revealed potential candidate genes responsible for phenotypes observed. Relying on selection criteria defined, four transformants were characterized in detail. Three of them are non-pathogenic and one mutant exhibits a drastically impaired virulence within infection assays on whole wheat plants. Using genome walking, the T-DNA integration sites could be recovered, and the disrupted genomic loci of corresponding mutants were validated by reverse genetics approach. We present four functionally characterized genes involved in the dimorphic switch of the fungal plant pathogen Z. tritici, yet not described in the literature. In addition, transcriptome analysis of selected mutant strains by RNA-Seq was performed to get first insight into regulons associated with yeast-to-hyphal transition. The outcome of the RNA-Seq analysis provides a substantial list of target genes proposed to be implicated in regulation of dimorphic switch. Among the genes obtained, were those, whose role in the pathomorphogenic processes was previously established in other fungal pathogens. Moreover, making use of bioinformatic analysis, we also identified sets of differentially expressed genes previously not described and likely having unique role for dimorphic switch in Z. tritici. Based on these data, one further gene was characterized. This gene probably encodes an essential transcription factor, responsible for the coordination of meiotic division and spore formation. Based on results obtained from in silico analysis, its role for cellular processes in Z. tritici will be discussed.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde Zymoseptoria tritici (teleomorph Mycosphaerella graminicola), als einer der wichtigsten Schadpilze im Getreideanbau, untersucht. Dieser Pilz verursacht Septoria-Blattdürrekrankheit an Weizen (Septoria blotch disease), welche jährlich massive Ernteausfälle zur Folge hat. Charakteristisches Merkmal dieses Pilzes ist seine Fähigkeit zur dimorphen Transition. Zum einen ist es die hefeähnliche Wachstumsform, welche man auf nährstoffreichen Kultivierungsmedien beobachtet. Zum anderen die filamentöse Wachstumsform, welche bei Nährstoffmangel induziert wird. Letztere ist mit der Pathogenität des Pilzes assoziiert und ist eine essentielle Voraussetzung für die erfolgreiche Infektion der Pflanze. Ein vorwärts-gerichteter genetischer Ansatz (forward genetics) wurde verwendet, um die molekulare Basis der morphologischen Transition zu untersuchen. Die zuvor entwickelte und etablierte Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation wurde verwendet, um eine Bibliothek mit über 10000 Transformanten durch eine insertionelle Mutagenese zu erzeugen. Desweiteren wurde ein plattenbasiertes Screening-System etabliert, das eine Identifizierung von Mutantenstämmen mit Defekten in der dimorphen Transition ermöglicht. Mit diesem Ansatz wurden elf „dimorphic switch“ defizienten Mutanten isoliert, von denen zehn durch ein hefeartiges Wachstum charakterisiert sind und eine Mutante, die überwiegend filamentös wächst und durch eine erhöhte Myzelformation unter verschiedenen Inkubationsbedingungen gekennzeichnet ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten vier Mutanten, die gemäß definierten Selektionskriterien ausgewählt wurden, im Detail charakterisiert werden. Drei von ihnen sind apathogen und eine Mutante zeichnet sich durch eine stark verminderte Virulenz gegenüber der Wirtspflanze aus. Mit dem bereits etablierten genome walking Ansatz konnten die T-DNA-Insertionsstellen im Genom der erzeugten random Mutanten lokalisiert werden. Die korrespondieren Genloci wurden mittels gezielter Inaktivierung der entsprechenden Gene validiert. Im Zuge dieser Arbeit werden somit vier funktionell charakterisierte Gene präsentiert, die eine wichtige Rolle in der Regulation der morphologischen Transition Z. tritici spielen. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Transkriptom-Analyse mittels RNA-Seq mit vier ausgewählten Mutanten unter der „switch“-induzierenden Kultivierungsbedingung durchgeführt, um einen tiefgehenden Einblick in die dimorphic switch assoziierte Prozesse zu gewinnen. Zusammen mit dem Ergebnis einer gene enrichment Analyse wird eine Liste von Dimorphismus-relevanten Genen präsentiert, die eine exzellente Basis für die weiterführende Untersuchung an diesem wichtigen pathogenitätsrelevanten Prozess darstellt. Gestützt auf die bioinformatische Analyse der RNA-Seq Daten wurde letztlich ein weiteres Gen charakterisiert. Dieses Gen kodiert vermutlich einen essentiellen Transkriptionsfaktor, der in anderen Pilzen für die Koordinierung von meiotischer Kernteilung und Sporenbildung zuständig ist. Basierend auf den Ergebnissen der durchgeführten in silico Analyse wird seine Rolle für zelluläre Prozesse in Z. tritici diskutiert.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4108
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 212 Seiten
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