Authors:	Wörner, Sebastian
Title:	Der Transporter DcuB als funktioneller Schalter zwischen freiem DcuS und dem sensorisch aktiven DcuS/DcuB-Sensorkomplex
Online publication date:	20-Dec-2017
Year of first publication:	2017
Language:	german
Abstract:	Der C4-Dicarboxylatstoffwechsel von Escherichia coli wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Zu den Zielgenen von DcuSR gehören auch dctA und dcuB, die für den aeroben Transporter DctA bzw. den anaeroben Transporter DcuB kodieren. Die Transporter bilden mit der Sensorkinase DcuS DctA/DcuS- bzw. DcuB/DcuS-Sensorkomplexe. In dieser Arbeit wurde die Rolle des anaeroben Transporters DcuB bei der Signalerkennung in dem DcuB/DcuS-Sensorkomplex untersucht. Substrate wie Fumarat, L-Malat, L-Aspartat wurden von DcuS und von DcuB erkannt. Die C4-Dicarboxylate und Strukturanaloga Maleinat, meso-Tartrat, Citrat und 3-Nitropropionat sind Induktoren von dcuB-lacZ, haben jedoch keinen Einfluss auf die Transportaktivität von DcuB. Die Signalerkennung erfolgt im DcuB/DcuS-Komplex demnach allein durch DcuS; DcuB dient nicht als zweiter Signaleingang. DcuB ist jedoch als strukturelle Komponente erforderlich, um DcuS im DcuB/DcuS-Komplex in die sensorisch kompetente Form zu überführen. In der Gegenwart von Fumarat wird dann der DcuS/DcuB-Komplex aktiviert. Die zellulären Gehalte von DcuS, DctA und DcuB wurden unter verschiedenen Bedingungen massenspektrometrisch aus Membranpräparationen quantifiziert. Im Wildtyp W3110 waren nach aerober Zucht etwa 10 Moleküle DcuS und 198 Moleküle DctA pro Zelle zu finden. Der DctA-Gehalt stieg nach Zugabe von Fumarat auf 583 Moleküle pro Zelle. Nach anaerober Zucht waren etwa 23 Moleküle DcuS und 273 Moleküle DcuB pro Zelle zu finden. Durch Fumarat stieg der DcuB-Gehalt 3396 Moleküle pro Zelle an. Die Gehalte an freiem DcuS wurden anhand der unterschiedlichen sensorischen Eigenschaften von DcuSF und DcuS im DcuB/DcuS-Komplex abgeschätzt. Danach liegt DcuS immer nahezu vollständig als DcuS/DcuB- oder DcuS/DctA-Komplex vor. Die Bildung des DcuS/DcuB-Komplexes stellt einen Schalter dar, durch den zwischen den beiden grundlegenden Funktionsmodi von DcuS gewechselt wird. Im Modus I liegt DcuS als DcuS/DcuB-Sensorkomplex vor, der durch Bindung eines Effektors wie Fumarat reguliert wird. In Modus II liegt DcuS als freies DcuSF vor, das bereits ohne Effektor aktiv ist. Die Gehalte an DcuSF sind stets sehr niedrig. C4-Dicarboxylate stellen im Säugetierdarm gut verfügbare Metabolite dar, die aber meist nur in niedrigen Konzentrationen vorkommen. Im Funktionsmodus II liegt eine negative Rückkopplung vor, die eine niedrige basale Expression von DcuB gewährleistet. Dadurch kann E. coli auch niedrige C4-Dicarboxylat-Konzentrationen im Säugetierdarm nutzen, bei denen der C4-Dicarboxylat Stoffwechsel nicht oder nur schwach über DcuS aktiviert wird. C4-dicarboxylate metabolism of Escherichia coli is regulated by the two component system DcuSR. The target genes of DcuSR include dctA and dcuB, encoding the aerobic and anaerobic transporters DctA and DcuB, respectively. The transporters form a DctA/DcuS or a DcuB/DcuS sensor complex with the sensor kinase DcuS. In this study, the role of the anaerobic transporter DcuB for signal perception in the DcuB/DcuS sensor complex was analyzed. Substrates like fumarate, L-malate, L-aspartate were recognized by DcuS and DcuB. C4-dicarboxylates and structural analogues like maleate, meso-tartrate, citrate and 3-nitropropionate induce dcuB-lacZ but have no influence on the transport activity of DcuB. Therefore, signal perception in the DcuB/DcuS sensor complex occurs only by DcuS, and DcuB does not serve as secondary input site. However, DcuB is necessary as a structural component that transfers DcuS to a sensory competent DcuB/DcuS complex. The DcuB/DcuS complex is activated by the presence of fumarate. Cellular contents of DcuS, DctA and DcuB were quantified from membrane preparations via mass spectrometry under different conditions. In the wildtype W3110 10 molecules DcuS and 198 molecules DctA were found per cell after aerobic growth. Addition of fumarate to the growth medium resulted in increased DctA contents (583 molecules per cell). After anaerobic growth 23 molecules DcuS and 273 molecules DcuB were found per cell. DcuB contents increased to 3396 molecules per cell after anaerobic growth on fumarate. Contents of free DcuSF were estimated by comparing the different properties of DcuSF and DcuS in the DcuB/DcuS complex. Thus, DcuS is almost exclusively present as DcuB/DcuS or DctA/DcuS complex. The formation of the DcuB/DcuS complex represents a molecular switch between the two fundamental functional modes of DcuS. In mode I DcuS is present as DcuB/DcuS sensor complex which is regulated by binding an effector like fumarate. In mode II DcuS is present as DcuSF which is active even in absence of an effector. DcuSF contents are always very low. C4-dicarboxylates are abundant metabolites in the mammalian gut where they are mostly found in low concentrations only. Mode II regulation of DcuS includes negative feedback regulation which ensures a low basal expression of DcuB. This allows E. coli to utilize low concentrations of C4-dicarboxylates in the mammalian gut which do not or only weakly activate C4-Dicarboxylate metabolism via DcuS.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4107
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000017017
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	IV, 111 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen