Authors:	Bartusch, Christina
Title:	Virus-Wirt-Interaktionen während der Morphogenese des Murinen Leukämievirus und des humanen Hepatitis-B-Virus : die Rollen zellulärer ESCRT- und Rab-Proteine
Online publication date:	20-Dec-2017
Year of first publication:	2017
Language:	german
Abstract:	Viren garantieren ihre Verbreitung durch selektive Manipulationen zellulärer Protein-Maschinerien. Das Zusammenspiel von viralen und zellulären Komponenten bedarf dabei einer präzisen Regulation, die durch das Virus vermittelt wird. Kritische Virus-Wirt-Interaktionen in späten Schritten des viralen Lebenszyklus ereignen sich während des Transports der viralen Komponenten zum Ort des Zusammenbaus und während der nicht-lytischen Virionen-Abschnürung und -Freisetzung. Die zelluläre ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-Maschinerie wird von einigen Viren für ihre Abschnürung missbraucht. Hierzu stellen sog. late-Domänen der viralen Strukturproteine den Kontakt zum ESCRT-Komplex her. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der ESCRT-Kaskade in der Morphogenese des umhüllten, retroviralen Murinen Leukämievirus (MLV) untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die MLV-Morphogenese die ESCRT-I-Untereinheit Tsg101 benötigt, während der gesamte ESCRT-II-Komplex entbehrlich ist. Die detaillierte Analyse des ESCRT-III-Komplexes ergab überraschend, dass lediglich CHMP1A, CHMP2A und CHMP4B an der MLV-Sprossung beteiligt sind. Die Inaktivierung von CHMP1A beeinträchtigte zudem auch die Prozessierung und intrazelluläre Verteilung des Gag/Pol-Polyproteins. Demnach scheint CHMP1A zusätzlich eine Adaptor-ähnliche, ESCRT-unabhängige Funktion im Transport der viralen Polyproteine zum Sprossungsort auszuüben und/oder den Kontakt zur viralen Protease zu vermitteln. Auch konnte die Notwendigkeit für die Nedd4-1 Ubiquitin-Ligase bestätigt werden, während der ESCRT-Adaptor Alix eine untergeordnete Rolle spielt. Diese Befunde zeigten auch, dass sich MLV-Virionen und MLV Virus-ähnliche Partikel (MLV-VLPs) hinsichtlich ihrer Anforderungen an die ESCRT-Maschinerie unterscheiden. Das Hepatitis-B-Virus (HBV), ein umhülltes Pararetrovirus, nutzt ebenso zelluläre ESCRT-Funktionen zur Sprossung. Jedoch sind Transportmechanismen der viralen Komponenten zum Sprossungsort ungeklärt. Daher hatte diese Arbeit zum Ziel, die Rolle des zellulären Rab GTPase-Transportnetzwerks in der HBV-Biogenese aufzuklären. Mit Hilfe von RNA-Interferenz und dominant-negativen Mutanten konnten Rab1A, Rab6A, Rab18, Rab33B und Rab34 als provirale Rab-Proteine identifiziert werden, die in katalytisch-aktiver Form wirken. Rab33B reguliert den Transport des viralen Cores/Kapsids zur Bildungsstätte der Nukleokapside (NC) und/oder den NC-Transport zum Umhüllungsort. Hierbei wirkt Rab33B vermutlich im Zusammenspiel mit seinem autophagosomalen Atg5/12/16L1-Effektorprotein. Ähnlich könnte auch Rab1A aufgrund seiner Verbindung zum Autophagie-Netzwerk die Bildung von NCs positiv steuern. Nach dem Zusammenbau der NCs scheint Rab6A deren Transport zum Ort der Umhüllung zu eskortieren. Rab18 kontrolliert den Transport der HBV-Strukturporteine zum Synthese-/Knospungsort. Der Rab34/RILP/ESCRT-II-Superkomplex mit assoziiertem Core könnte während später Schritte der HBV-Morphogenese gewährleisten, dass HBV Zugang zum ESCRT-III/VPS4-Komplex erhält, der die finale Virus-Abschnürung katalysiert. Viruses ensure their replication and release through diverse manipulation of cellular protein machineries. Therefore, many viruses depend on a close interplay between viral and cellular proteins. In late steps of the viral life cycle of enveloped viruses, productive virus-host interactions occur during the transport of viral components to the assembly site and during non-lytic budding. Many viruses abuse the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) machinery for budding. Viruses recruit the ESCRT proteins through specific tetrapeptide motifs within their Gag polyproteins, the so-called late domains. The aim of this thesis was to elucidate the role of ESCRT complexes in the morphogenesis of murine leukemia virus (MLV), an enveloped retrovirus. By studying the requirements of MLV virion morphogenesis, it was uncovered that the ESCRT-I factor Tsg101 is essential, whereas ESCRT-II was dispensable. By analyzing the effects of individual ESCRT-III knockdowns, only CHMP1A, CHMP2A and CHMP4B were specifically required for MLV budding. Furthermore, the depletion of CHMP1A resulted in a prominent decline of Gag and Gag/Pol processing by the viral protease and an accumulation of Gag in the cell periphery. Although the role of CHMP1A is not completely dissected yet, it could play an adaptor-like role guiding proper trafficking and targeting of Gag and Gag/Pol to the budding site and the viral protease. Additionally, Nedd4-1 is necessary in MLV morphogenesis, whereas the ESCRT adaptor protein Alix seems to play an auxiliary role. Hence, MLV virions and MLV virus-like particles (VLPs) share some requirements of the ESCRT machinery, but clearly differ in their needs for CHMP1A. For Hepatitis B virus (HBV), an enveloped pararetrovirus, it has also been reported that budding occurs at intracellular membranes with the assistance of the ESCRT machinery. However, many steps accompanying HBV morphogenesis are not resolved yet, in particular, the transport mechanisms of the viral proteins to sites of assembly/budding are largely unknown. The aim of this thesis was to unravel the engagement of Rab GTPases by HBV during its assembly and release. By using RNA-mediated silencing and overexpression of dominant-negative mutants, catalytic active forms of Rab1A, Rab6A, Rab18, Rab33B, and Rab34 were identified as proviral Rab proteins. Rab33B is involved in the transport of core to nucleocapsid (NC) assembly sites and/or transport of NCs to budding sites. Thereby, Rab33B acts presumably in conjunction with its autophagic effector, the Atg5-12/16L1 complex. Rab1A appears to be an important player in the formation of NCs, likely due to its link to the autophagy machinery. The function of Rab6A is vague, but it may control the transport of NCs to the budding site. Rab18 could escort viral proteins to the assembly/budding site. A Rab34/RILP/ESCRT-II complex along with associated HBV core could recruit the ESCRT-III/VPS4 complex in order to facilitate the final fission and budding events.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4106
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000017007
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XVII, 173 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen