Meprin beta: a prominent player in the sequence specific generation of N-terminally truncated A-beta in the human brain
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Abstract
Die Generierung von amyloid β (Aβ) Peptiden durch sequentielle Prozessierung des Amyloiden Vorläufer Proteins (APP) durch Sekretasen ist ein normaler Prozess der im gesunden Gehirn auftritt. Trotzdem ist dieses Peptid eines der meist untersuchtesten Targets in der Alzheimer (AD) Forschung, da das erhöhte Auftreten von aggregationsanfälligen Varianten dieses Peptids und die daraus resultierenden Ablagerungen, bzw. senilen Plaques ein pathologisches Merkmal der Erkrankung darstellen. Die verantwortlichen Sekretasen zur Aβ Generierung sind zum einen die β-Sekretase BACE-1 (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1), welche den N-Terminus in Position p1 oder p11 des Peptids schneidet, und zum anderen die γ-Sekretase, welche den C-Terminus an variablen Positionen scheiden kann, und somit Peptide variierender Länge sezerniert. Allerdings wurden sowohl in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) als auch im Gehirn von AD Patienten N-terminal trunkierte Aβ Varianten entdeckt, die nicht der BACE-1 Prozessierung zugeordnet werden können. Diese Varianten wurden als besonders aggregationsanfällig charakterisiert und rückten dadurch in aktuellen AD Studien mehr in den Fokus. Einen Kandidaten für diesen C-terminal verschobenen Schnitt des N-Terminus stellt die Metalloprotease Meprin β dar. 2011 zeigten Jefferson und Kollegen in einer Proteomics Analyse, dass APP ein potentielles Substrat für Meprin β repräsentiert. Die Ergebnisse zeigten des Weiteren, dass Meprin β N-terminale APP Fragmente generieren kann. Die Prozessierung von APP durch Meprin β wurde in einer weiteren Studie bestätigt, die zeigt, dass die Protease N-terminal trunkierte Aβ Peptide erzeugt. Zudem konnten erhöhte Meprin β mRNA Level in Gehirnen von AD Patienten gemessen werde.
In Einklang mit diesen Ergebnissen konnten in der vorliegenden Arbeit erhöhte Meprin β Proteinlevel in Gehirnen von AD Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen und einer nicht-AD, aber neurodegenerativ erkrankten Kontrollgruppe detektiert werden. Zudem legen die Ergebnisse dieser Arbeit dar, dass sAPPα Level in Hirnhomogenaten von Mep1b-/- Mäusen höher ausfallen als in jenen wildtypischer Kontrollen, obgleich die endogenen Meprin β Proteinlevel unter physiologischen Bedingungen sehr niedrig sind, was darauf hindeutet, dass die Protease einen hohen Substratumsatz aufweist. Bei einem Fehlen der Protease scheint folglich mehr Substrat für die α-Sekretase ADAM10 (A disintegrin and metalloprotease) zur Verfügung zu stehen. In Präzipitaten aus Zellkulturüberständen primärer Neuronen derselben Mäuse, welche mit einem rekombinanten Virus, der humanes APP überexprimiert, infiziert wurden, konnte für Mep1b-/- eine geringere Konzentration an Aβ2-40 gemessen werden.
Dieselbe N-terminal trunkierte Aβ Variante konnten in dieser Arbeit in humanen Gehirnen detektiert werden. Es zeigte sich, dass das Aβ2-40/1-40 Verhältnis in Frontallappen von AD Patienten erhöht ist. Wie bereits zuvor für andere N-terminal trunkierte Aβ Varianten beschrieben, wurde kürzlich gezeigt, das Aβ2-40 sehr aggregationsanfällig ist.
Um die Interaktion von APP und Meprin β genauer zu untersuchen, wurde die subzelluläre Lokalisation dieser analysiert. Dies erfolgte durch konfokale Mikroskopie einer Zelloberflächenfärbung und eines „split-GFP“ basierten Komplementationsversuchs. Somit konnte die Interaktion dem späten Sektretionsweg und der Zelloberfläche zugeordnet werden. Dadurch scheint diese räumlich von der Interaktion von APP mit BACE-1 getrennt zu sein, welche in endosomalen Vesikeln stattfindet.
Ein weiterer Hauptbestandteil dieser Arbeit war die Untersuchung von Mutationen in der APP Sequenz, welche mit der familiären Form von AD (FAD) assoziiert werden, und deren Effekt auf die Spaltung durch Meprin β. Interessanterweise stellte sich heraus, dass die Schwedische Doppelmutation APPswe (K670N/M671L) die Protease derartig beeinflusst, dass kein Aβ2-40 generiert werden kann. Neben den bekannten APP Mutationen, welche mit FAD in Verbindung gebracht werden, wurde kürzlich eine APP Mutation unmittelbar an der β-Schnittstelle entdeckt. Die APP A673T Mutation wurde als protektiv beschrieben, welche vor BACE-vermittelter Aβ Produktion schützt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war deshalb, den Effekt der Mutation auf Meprin β zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass die Mutation auch einen protektiven Effekt gegen den Meprin β Schnitt aufweist.
Vorläufige Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf einen Effekt von Aβ1-42 auf die Meprin β Genregulation hin, da nach Inkubation mit Aβ1-42 erhöhte Meprin β mRNA Level in N2a gemessen werden konnten.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Meprin β ein wichtiger Kandidat für zukünftige Studien bezüglich der APP Prozessierung darstellt. Aufgrund des Potenzials N-terminal trunkiertes Aβ2-40 zu generieren, scheint Meprin β eine wichtige Rolle in der AD Pathogenese einzunehmen.