Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4099
Authors: Schönherr, Caroline
Title: Meprin beta: a prominent player in the sequence specific generation of N-terminally truncated A-beta in the human brain
Online publication date: 27-Jul-2016
Year of first publication: 2016
Language: english
Abstract: Die Generierung von amyloid β (Aβ) Peptiden durch sequentielle Prozessierung des Amyloiden Vorläufer Proteins (APP) durch Sekretasen ist ein normaler Prozess der im gesunden Gehirn auftritt. Trotzdem ist dieses Peptid eines der meist untersuchtesten Targets in der Alzheimer (AD) Forschung, da das erhöhte Auftreten von aggregationsanfälligen Varianten dieses Peptids und die daraus resultierenden Ablagerungen, bzw. senilen Plaques ein pathologisches Merkmal der Erkrankung darstellen. Die verantwortlichen Sekretasen zur Aβ Generierung sind zum einen die β-Sekretase BACE-1 (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1), welche den N-Terminus in Position p1 oder p11 des Peptids schneidet, und zum anderen die γ-Sekretase, welche den C-Terminus an variablen Positionen scheiden kann, und somit Peptide variierender Länge sezerniert. Allerdings wurden sowohl in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) als auch im Gehirn von AD Patienten N-terminal trunkierte Aβ Varianten entdeckt, die nicht der BACE-1 Prozessierung zugeordnet werden können. Diese Varianten wurden als besonders aggregationsanfällig charakterisiert und rückten dadurch in aktuellen AD Studien mehr in den Fokus. Einen Kandidaten für diesen C-terminal verschobenen Schnitt des N-Terminus stellt die Metalloprotease Meprin β dar. 2011 zeigten Jefferson und Kollegen in einer Proteomics Analyse, dass APP ein potentielles Substrat für Meprin β repräsentiert. Die Ergebnisse zeigten des Weiteren, dass Meprin β N-terminale APP Fragmente generieren kann. Die Prozessierung von APP durch Meprin β wurde in einer weiteren Studie bestätigt, die zeigt, dass die Protease N-terminal trunkierte Aβ Peptide erzeugt. Zudem konnten erhöhte Meprin β mRNA Level in Gehirnen von AD Patienten gemessen werde. In Einklang mit diesen Ergebnissen konnten in der vorliegenden Arbeit erhöhte Meprin β Proteinlevel in Gehirnen von AD Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen und einer nicht-AD, aber neurodegenerativ erkrankten Kontrollgruppe detektiert werden. Zudem legen die Ergebnisse dieser Arbeit dar, dass sAPPα Level in Hirnhomogenaten von Mep1b-/- Mäusen höher ausfallen als in jenen wildtypischer Kontrollen, obgleich die endogenen Meprin β Proteinlevel unter physiologischen Bedingungen sehr niedrig sind, was darauf hindeutet, dass die Protease einen hohen Substratumsatz aufweist. Bei einem Fehlen der Protease scheint folglich mehr Substrat für die α-Sekretase ADAM10 (A disintegrin and metalloprotease) zur Verfügung zu stehen. In Präzipitaten aus Zellkulturüberständen primärer Neuronen derselben Mäuse, welche mit einem rekombinanten Virus, der humanes APP überexprimiert, infiziert wurden, konnte für Mep1b-/- eine geringere Konzentration an Aβ2-40 gemessen werden. Dieselbe N-terminal trunkierte Aβ Variante konnten in dieser Arbeit in humanen Gehirnen detektiert werden. Es zeigte sich, dass das Aβ2-40/1-40 Verhältnis in Frontallappen von AD Patienten erhöht ist. Wie bereits zuvor für andere N-terminal trunkierte Aβ Varianten beschrieben, wurde kürzlich gezeigt, das Aβ2-40 sehr aggregationsanfällig ist. Um die Interaktion von APP und Meprin β genauer zu untersuchen, wurde die subzelluläre Lokalisation dieser analysiert. Dies erfolgte durch konfokale Mikroskopie einer Zelloberflächenfärbung und eines „split-GFP“ basierten Komplementationsversuchs. Somit konnte die Interaktion dem späten Sektretionsweg und der Zelloberfläche zugeordnet werden. Dadurch scheint diese räumlich von der Interaktion von APP mit BACE-1 getrennt zu sein, welche in endosomalen Vesikeln stattfindet. Ein weiterer Hauptbestandteil dieser Arbeit war die Untersuchung von Mutationen in der APP Sequenz, welche mit der familiären Form von AD (FAD) assoziiert werden, und deren Effekt auf die Spaltung durch Meprin β. Interessanterweise stellte sich heraus, dass die Schwedische Doppelmutation APPswe (K670N/M671L) die Protease derartig beeinflusst, dass kein Aβ2-40 generiert werden kann. Neben den bekannten APP Mutationen, welche mit FAD in Verbindung gebracht werden, wurde kürzlich eine APP Mutation unmittelbar an der β-Schnittstelle entdeckt. Die APP A673T Mutation wurde als protektiv beschrieben, welche vor BACE-vermittelter Aβ Produktion schützt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war deshalb, den Effekt der Mutation auf Meprin β zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass die Mutation auch einen protektiven Effekt gegen den Meprin β Schnitt aufweist. Vorläufige Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf einen Effekt von Aβ1-42 auf die Meprin β Genregulation hin, da nach Inkubation mit Aβ1-42 erhöhte Meprin β mRNA Level in N2a gemessen werden konnten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Meprin β ein wichtiger Kandidat für zukünftige Studien bezüglich der APP Prozessierung darstellt. Aufgrund des Potenzials N-terminal trunkiertes Aβ2-40 zu generieren, scheint Meprin β eine wichtige Rolle in der AD Pathogenese einzunehmen.
The generation of amyloid β (Aβ) variants by sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) is a normal process and occurs in the healthy brain. However, it is one of the most studied peptides in Alzheimer´s Disease (AD), since shifts in the composition of Aβ variants varying in length, and the increased occurrence of toxic variants that are prone to aggregate, are one of the major pathological hallmarks of AD pathogenesis. The primary secretases that are responsible for producing these peptides are the β-secretase BACE-1 (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1), cleaving N-terminally at position 1 or 11 of the Aβ sequence, and the γ-secretase, cleaving at various positions of the C-terminus of Aβ. Though, N-terminally truncated Aβ variants that have been detected in cerebrospinal fluid (CSF) and brain of AD patients that cannot be attributed to BACE-1 cleavage. These became the focus of recent studies, since they appear to be more prone to aggregate. One candidate enzyme for this cleavage event is the metalloprotease meprin β. Recently, a proteomics study identified APP as a potential substrate which could be further verified by demonstrating the role of meprin β in the generation of N-terminally truncated Aβ2-40. Moreover, increased levels of meprin β mRNA were observed in brains of AD patients. In line with this study, in this dissertation human brain samples of AD patients were analyzed and compared to non-demented age matched controls as well as to non-AD but neurodegeneration patients. An increased number of meprin β positive neurons and increased meprin β expression levels in lysates could be detected in AD samples compared to both control groups. Moreover, increased levels of sAPPα were observed in brains of Mep1b-/- mice compared to wild type (wt) mice, indicating that in the absence of meprin β more substrate is available for ADAM10. This difference could be detected even though endogenous meprin β levels are very low under physiological conditions. Additionally, a decrease of Aβ2-40 and an increase of mature APP in primary cortical neurons of Mep1b-/- mice infected with a recombinant adenovirus expressing human APP695 were detected. Moreover, the same Aβ variant could be detected in human brain homogenates and even more interesting, the Aβ2-40/1-40 ratio was increased in frontal lobe of AD patients. As seen for other N-terminally truncated Aβ peptides, Aβ2-40 has been shown to have an increased aggregation behavior compared to non-truncated variants and only little amounts of this variant had a drastic seeding effect on Aβ1-40. To study the interaction of APP and meprin β in more detail, the localization of this processing event was analyzed in vitro. Via confocal microscopy of a surface staining and a compartment staining in a split GFP based complementation assay, the interaction could be spatialized to the late secretory pathway and the cell surface, which locally separates it to the cleavage of BACE-1 that rather occurs in endosomal compartments. Most interestingly, the results of this work show that meprin β is incapable of generating N-terminally truncated Aβ2-40 of the Swedish mutated APPswe (K670N/M671L). Moreover, the results demonstrate that the recently described protective APP A673T mutation does not only decrease BACE-1 cleavage, but also diminishes meprin β cleavage. Furthermore, preliminary results suggest that Aβ1-42 has an effect on meprin β gene regulation since increased meprin β mRNA levels could be detected upon treatment of N2a cells with Aβ1-42. Concluding, this work underlines that the protease meprin β appears as an important candidate for further studies on APP processing and Aβ generation and may have a contributing role in the pathogenesis of AD.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4099
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000005933
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: X, 118 Blätter
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