Authors:	Kühle, Berit
Title:	Synthesis, evaluation and structural analysis of new ligands for the integrin alpha v beta 6 for PET imaging of liver fibrosis
Online publication date:	21-Jul-2016
Year of first publication:	2016
Language:	english
Abstract:	Liver fibrosis is a very frequent disease and often leads to the necessity of transplantation for the patient. This is due to the lack of any anti-fibrotic drugs – therefore, the typical treatment is purely causative. But the treatment of an underlying hepatitis B/C, non-alcoholic-steato hepatitis or alcohol abuse are not always sufficient in order to halt the diseases progression. Furthermore, the current diagnostic ‘gold standard’ of a biopsy is not ideal – the sample represents only a 1/50.000 of the whole organ, which can cause false-positive as well as false-negative results. Especially for intermediate stages, it is difficult to obtain information allowing conclusions about treatment efficiency. For that reason, the positron emission tomography (PET) is thought to be a promising technique, which could overcome the current diagnostic pitfalls, if a suitable tracer substance was given. The development of such a substance was the aim of this work. The integrin αvβ6 was chosen as the target structure, as it is directly involved in the fibrogenetic pathway and furthermore in the liver it is solely expressed by cholangiocytes. The high affinity ligand EMD527040 was therefore synthesized and two derivatives thereof were produced – to be used as labelling precursors for 68Ga, an easily available PET nuclide. For both substances, convenient labelling procedures were developed, yielding radiochemical yields of >95 %. Stability studies over two hours as well as the determination of their lipophilicity have successfully be performed. The in vitro studies on αvβ6 bearing cells though, did not show any retention on the receptor. Also tests on the isolated and immobilized integrin could not show a binding. This was supported from the biodistribution studies and PET images of both tracer substances – no significant difference between healthy and fibrotic mice was observed. Nevertheless, the more lipophilic substance was apparently metabolized via hepato biliary pathways while the more hydrophilic one was cleared via the kidneys. The logD value for further derivatives should therefore be below -0.19. As these results were unexpected, a computational study was initiated – a homology model of αvβ6 was derived from a template crystal structure of αvβ3. Furthermore, the electronic as well as electrostatic characteristics of literature known ligands (partially derivatized at the same position) were investigated and also docked to the homology model. A hypothesis could be derived which explains why our ligands did unexpectedly not bind to the target integrin and allowed the proposal of more promising structures. Leberfibrose ist eine relativ häufige Erkrankung, die in vielen Fällen zu einer Notwendigkeit der Lebertransplantation führt. Dies liegt im Fehlen von anti-fibrotischen Medikamenten begründet – die klassische Behandlung erfolgt daher kausativ. Häufig ist die Bekämpfung der zugrunde liegenden Hepatitis B/C, einer nicht-alkoholischen Steatohepatitis, oder von Alkoholmissbrauch aber nicht ausreichend um das Fortschreiten der Erkrankung zu verhindern. Außerdem, ist der momentane diagnostische ‚gold standard‘ einer Leberbiopsie ebenfalls problembehaftet. Da die Probe nur 1/50.000 des Gesamtorgans repräsentiert, können leicht falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse erhalten werden. Insbesondere für mittlere Schweregrade ist die differenzierte Diagnose schwierig. Daher wird der Einsatz der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) für vielversprechend gehalten, falls eine geeignete Tracer-Substanz gegeben ist. Die Entwicklung solch einer Substanz war das Ziel dieser Arbeit. Das Integrin αvβ6 wurde als Target Struktur gewählt, da es direkt in die fibrogenetischen Prozesse involviert ist und zudem innerhalb der Leber abgesehen von den Cholangiozyten von keinen weiteren Zellen exprimiert wird. Dazu wurde der für nanomolare Affinität bekannte Ligand EMD527040 synthetisiert und zwei Derivate konnten davon als Markierungsvorläufer für die Radiomarkierung mit 68Ga hergestellt werden. Für beide Substanzen wurden geeignete Markierungsprotokolle entwickelt mit denen radiochemische Ausbeuten von über 95 % erzielt werden können. Stabilitätsstudien über zwei Stunden, sowie die Bestimmung der Lipophilie wurden erfolgreich durchgeführt. In in vitro Studien konnte hingegen weder auf αvβ6-tragenden Zellen, noch am immobilisierten Integrin selbst eine Affinität nachgewiesen werden. Dies wurde in Biodistributionen und PET-Aufnahmen bestätigt – zwischen fibrotischen und gesunden Mäusen konnte kein signifikanter Unterschied beobachtet werden. Allerdings wurden verschiedene Stoffwechselwege beobachtet: Um eine Verstoffwechslung über die hepato-biliären Systeme zu verhindern, sollte daher der logD Wert für zukünftige Substanzen unter -0,19 liegen. Diese unerwarteten Resultate wurden mittels einer theoretischen Studie untersucht. Ein homologes Model des αvβ6 wurde anhand der für αvβ3 bekannten Kristallstruktur konstruiert. Außerdem wurden die elektronischen sowie elektrostatischen Eigenschaften literaturbekannter Liganden (teils an derselben Position derivatisiert) untersucht und an das αvβ6 Model gedockt. Hieraus konnte eine Hypothese abgeleitet werden, die die gefunden Unterschiede erklärt und einen Vorschlag für vielversprechendere Substanzen erlaubt.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4090
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000005838
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	163 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen