Beitrag zur Aufklärung der zellulären Rolle des humanen "neighbour of tid (not)" Gens
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Das Ziel dieser Arbeit war es, einen essentiellen Beitrag zur Aufklärung der zellulären Funktionen der durch das humane not-Gen kodierten Proteine zu erbringen. Obwohl das not-Gen für 17 Spleißformen kodiert, zeigten die Studien, dass nur die Transkript-Variante-1 und -4 translatiert werden. Der Nachweis, der durch diese Varianten kodierten Proteine zeigte, dass das Full-Length NOT-1 Protein primär am ER und das Full-Length NOT-4 Protein im Zytosol lokalisiert ist. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass sowohl das NOT-1- als auch das NOT-4 Protein prozessiert werden. Im Fall von NOT-1 sind die Spaltprodukte nicht nur am ER, sondern auch im Zytosol und im Zellkern lokalisiert. Ausführliche bioinformatische Analysen zur Charakterisierung des NOT-1 Proteins erlaubten erste grundlegende Informationen über die Struktur, die Anzahl und Position der potentiellen Transmembrandomänen, das Vorhandensein von Schnittstellen und hochkonservierten Sequenzmotiven, die mit bestimmten Funktionen assoziiert sind, zu gewinnen. Anhand dieser Daten wurde ein 2D-Modell entwickelt wonach das NOT-1 Protein am ER lokalisiert ist und aus 10 TMD besteht. Innerhalb der NOT-1 Sequenz konnten mehrere potentielle NRD-, PCSK1/2-, S1P-, PCSK7-Schnittstellen und u.a. zwei Kern-Lokalisierungs-Signale identifiziert werden. Die Proteinmuster deuten darauf hin, dass zumindest zwei S1P-Schnittstellen aktiv sind.
Mittels der Hefe Zwei-Hybrid Technik wurden 17 potentielle molekulare Partner - Synaptophysin-Like 1 (SYPL1), Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1 (LRP1), VAMP (Vesicle-Associated Membrane Protein)-Associated Protein A (VAPA), Sushi Repeat-Containing Protein X-Linked (SRPX), FK506 Binding Protein 8 (FKBP8), Guanylate-Binding Protein 1(GBP1), Heme Oxygenase 2 (HMOX2), BCL2/Adenovirus E1B 19 kDa Interacting Protein 3 (BNIP3), Oxysterol Binding Protein (OSBP), Oxysterol Binding Protein-Like 9 (OSBPL9), HLA Class II Histocompatibility Antigen Gamma Chain (CD74), Smoothelin (SMTN), SEC16 Homolog B (SEC16B), NDRG Family Member 2 (NDRG2), Inverted Formin-2 (INF2), Mitochondrially Encoded Cytochrome c OxidaseIII (MT-CO3), cAMP Responsive Element Binding Protein 3 (CREB3) - des NOT-1 Proteins identifiziert. Für die isolierten Liganden SYPL1, LRP1, VAPA, FKBP8, OSBP, OSBPL9 und CREB3 wurden die Interaktionsdomänen kartiert. Im Fall von SYPL1, LRP1, OSBP, OSBPL9 und CREB3 wurde die Interaktion in vivo bestätigt. Während das CREB3 Protein mit dem Full-Length NOT-1 Protein am ER bindet, interagieren SYPL1, LRP1, OSBP und OSBPL9 mit denen am ER und im Zytosol lokalisierten prozessierten NOT Formen. Die Involvierung der Liganden in eine Vielzahl von biologischen Prozessen zeigt, dass das NOT Protein ein multifunktionales Protein darstellt.
Die künftige Aufgabe wird daher die Ermittlung der spezifischen zellulären Funktionen der detektierten NOT Proteine umfassen. Im Kontext der identifizierten Interaktionen wird die Aufklärung der Bedeutung der NOT-Interaktion für die Funktion des jeweiligen Liganden den Schwerpunkt der Analysen darstellen.