Authors:	Hacker, Benedikt
Title:	Beitrag zur Aufklärung der zellulären Rolle des humanen "neighbour of tid (not)" Gens
Online publication date:	6-Jun-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	Das Ziel dieser Arbeit war es, einen essentiellen Beitrag zur Aufklärung der zellulären Funktionen der durch das humane not-Gen kodierten Proteine zu erbringen. Obwohl das not-Gen für 17 Spleißformen kodiert, zeigten die Studien, dass nur die Transkript-Variante-1 und -4 translatiert werden. Der Nachweis, der durch diese Varianten kodierten Proteine zeigte, dass das Full-Length NOT-1 Protein primär am ER und das Full-Length NOT-4 Protein im Zytosol lokalisiert ist. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass sowohl das NOT-1- als auch das NOT-4 Protein prozessiert werden. Im Fall von NOT-1 sind die Spaltprodukte nicht nur am ER, sondern auch im Zytosol und im Zellkern lokalisiert. Ausführliche bioinformatische Analysen zur Charakterisierung des NOT-1 Proteins erlaubten erste grundlegende Informationen über die Struktur, die Anzahl und Position der potentiellen Transmembrandomänen, das Vorhandensein von Schnittstellen und hochkonservierten Sequenzmotiven, die mit bestimmten Funktionen assoziiert sind, zu gewinnen. Anhand dieser Daten wurde ein 2D-Modell entwickelt wonach das NOT-1 Protein am ER lokalisiert ist und aus 10 TMD besteht. Innerhalb der NOT-1 Sequenz konnten mehrere potentielle NRD-, PCSK1/2-, S1P-, PCSK7-Schnittstellen und u.a. zwei Kern-Lokalisierungs-Signale identifiziert werden. Die Proteinmuster deuten darauf hin, dass zumindest zwei S1P-Schnittstellen aktiv sind. Mittels der Hefe Zwei-Hybrid Technik wurden 17 potentielle molekulare Partner - Synaptophysin-Like 1 (SYPL1), Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1 (LRP1), VAMP (Vesicle-Associated Membrane Protein)-Associated Protein A (VAPA), Sushi Repeat-Containing Protein X-Linked (SRPX), FK506 Binding Protein 8 (FKBP8), Guanylate-Binding Protein 1(GBP1), Heme Oxygenase 2 (HMOX2), BCL2/Adenovirus E1B 19 kDa Interacting Protein 3 (BNIP3), Oxysterol Binding Protein (OSBP), Oxysterol Binding Protein-Like 9 (OSBPL9), HLA Class II Histocompatibility Antigen Gamma Chain (CD74), Smoothelin (SMTN), SEC16 Homolog B (SEC16B), NDRG Family Member 2 (NDRG2), Inverted Formin-2 (INF2), Mitochondrially Encoded Cytochrome c OxidaseIII (MT-CO3), cAMP Responsive Element Binding Protein 3 (CREB3) - des NOT-1 Proteins identifiziert. Für die isolierten Liganden SYPL1, LRP1, VAPA, FKBP8, OSBP, OSBPL9 und CREB3 wurden die Interaktionsdomänen kartiert. Im Fall von SYPL1, LRP1, OSBP, OSBPL9 und CREB3 wurde die Interaktion in vivo bestätigt. Während das CREB3 Protein mit dem Full-Length NOT-1 Protein am ER bindet, interagieren SYPL1, LRP1, OSBP und OSBPL9 mit denen am ER und im Zytosol lokalisierten prozessierten NOT Formen. Die Involvierung der Liganden in eine Vielzahl von biologischen Prozessen zeigt, dass das NOT Protein ein multifunktionales Protein darstellt. Die künftige Aufgabe wird daher die Ermittlung der spezifischen zellulären Funktionen der detektierten NOT Proteine umfassen. Im Kontext der identifizierten Interaktionen wird die Aufklärung der Bedeutung der NOT-Interaktion für die Funktion des jeweiligen Liganden den Schwerpunkt der Analysen darstellen. An essential contribution to elucidate the cellular functions of the proteins encoded by the human not-gene was the aim of this thesis. Although the not-gene encodes 17 splice forms, the studies showed that only the transcript variants 1 and 4 are translated. Detection of the proteins encoded by these transcript variants demonstrated that the full-length NOT-1 protein is primarily located at the ER whereas the full-length NOT-4 protein is located in the cytosol. Importantly, both NOT proteins are processed. The cleavage products of NOT-1 are not only located at the ER but also in the cytosol and the nucleus. Detailed bioinformatics analyses to characterize the NOT-1 protein revealed first fundamental information about its structure, number and position of transmembrane domains, cleavage sites and highly conserved sequence motifs associated with specific functions. On the basis of these data a 2D model was developed whereby the NOT-1 protein is located at the ER and consists of 10 TMD. Several potential NRD-, PCSK1/2-, S1P-, PCSK7 cleavage sites and two nuclear localization signals within the NOT-1 sequence were identified. The protein pattern suggests that at least two S1P cleavage sites are active. Using the yeast two-hybrid system 17 potential molecular partners - Synaptophysin-like 1 (SYPL1), Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1), VAMP (Vesicle-associated membrane protein)-associated protein A (VAPA), Sushi repeat-containing protein X-linked (SRPX), FK506 binding protein 8 (FKBP8), Guanylate-binding protein 1(GBP1), Heme oxygenase 2 (HMOX2), BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3 (BNIP3), Oxysterol binding protein (OSBP), Oxysterol binding protein-like 9 (OSBPL9), HLA class II histocompatibility antigen gamma chain (CD74), Smoothelin (SMTN), SEC16 homolog B (SEC16B), NDRG family member 2 (NDRG2), Inverted formin-2 (INF2), Mitochondrially encoded cytochrome c oxidaseIII (MT-CO3), cAMP responsive element binding protein 3 (CREB3) - were identified. The binding Domains for the isolated ligands SYPL1, LRP1, VAPA, FKBP8, OSBP, OSBPL9 and CREB3 were mapped. In case of SYPL1, LRP1, OSBP, OSBPL9 and CREB3 the interaction was confirmed in vivo. While the CREB3 protein interacts with the full-length NOT-1 Protein at the ER the ligands SYPL1, LRP1, OSBP and OSBPL9 interact with the processed NOT forms located at the ER and in the cytosol. Since the NOT ligands are involved in multiple biological processes, it may represent a multifunctional protein. Future research will therefore encompass the determination of the specific cellular functions of the detected NOT proteins. Concerning the identified interactions the following analyses will focus on the elucidation of the relevance of the NOT interactions for the function of each ligand.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4044
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000005092
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	159 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen