Authors:	Felkl, Marco
Title:	Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des synaptischen Vesikelproteins Synaptophysin
Online publication date:	25-Feb-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Die neuronale Signalübertragung beruht auf dem synaptischen Vesikelzyklus, der durch das koordinierte Zusammenspiel von circa 400 verschiedenen Proteinen reguliert wird. Eines der Hauptproteine des synaptischen Vesikels ist Synaptophysin (SYP), das zu den tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) gehört. Es wird vermutet, dass es zahlreiche Funktionen der Exo- und Endozytose moduliert, wenngleich die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher größtenteils unverstanden sind. Ziel der Arbeit war daher die Identifizierung von Interaktionspartnern von SYP, um zum Verständnis der vielen ungeklärten Prozesse im synaptischen Vesikelzyklus beizutragen. Mit dem Split-Ubiquitin Yeast Two-Hybrid System, das eine direkte in vivo Interaktion von Membranproteinen erlaubt, konnten in der vorliegenden Arbeit bekannte, aber auch neue SYP-Bindungspartner identifiziert werden. Ein bekannter Interaktionspartner war Synaptobrevin2 (SYB2), das zu den stärksten im Split-Ubiquitin Y2H System identifizierten Bindeproteinen zählt. Zu den neuen starken SYP-Interaktionspartnern gehören die TVPs Synaptogyrin3 (SYNGR3) und SCAMP1. Somit konnten erstmals heterophile Interaktionen zwischen den verschiedenen TVP-Genfamilien nachgewiesen werden, die für eine universelle Funktion der TVPs sprechen. r Die Validierung der im Split-Ubiquitin Y2H System ermittelten Interaktionspartner wurde auf eine Auswahl von Proteinen beschränkt, die vermutlich am synaptischen Vesikelzyklus beteiligt sind. Dabei konnte eine immunhistologische Kolokalisierung von SYP mit SYB2, SYNGR3, SCAMP1, Stathmin-like3 (STMN3), Rho family GTPase2 (RND2), Phospholipid transfer protein, Vesicle transport through interaction with t-SNAREs 1B homolog, Arfaptin2 und Profilin1 in den Synapsen-reichen Schichten der Retina beobachtet werden. Die SYP/SYB2- und SYP/SYNGR3-Komplexe konnten zudem sowohl aus Synaptosomen-Lysat als auch aus cDNA-transfizierten Epithelzellen koimmunpräzipitiert werden, wohingegen dies für die anderen Interaktionspartner nicht gelang. Da Koimmunpräzipitation die Struktur der Proteine durch Solubilisierung mit Detergenzien beeinflusst, wurden die in der Hefe beobachteten Interaktionen noch mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer überprüft, mit dem Proteinwechselwirkungen in der nativen Umgebung nachgewiesen werden können. Ein positives FRET-Signal konnte für SYP mit SYB2, SYP, SYNGR3, SCAMP1, STMN3, RND2 und Arfaptin2 detektiert werden, lediglich für SYP mit Phospholipase D4 (PLD4) gelang dieser Nachweis nicht. Ferner zeigten FRET-Analysen von Synaptophysin-Mutanten, dass der zytoplasmatische C-Terminus für die Interaktion mit zytoplasmatischen und membranassoziierten Proteinen benötigt wird. Durch in vivo FRET-Studien mit der SH2-Domäne der Src-Kinase, die an phosphorylierte Tyrosine bindet, konnte eine Tyrosin-Phosphorylierung des zytoplasmatischen C-Terminus von Synaptophysin und von Synaptogyrin3 detektiert werden. Viele der neu identifizierten Synaptophysin-Interaktionspartner sind im Lipid-Metabolismus involviert. Vermutlich rekrutiert der zytoplasmatische und durch Phosphorylierung modifizierbare C-Terminus diese Partner in spezifische Lipoproteindomänen, die an der Feinabstimmung der synaptischen Vesikelendo- und -exozytose beteiligt sind. Neuronal signal transduction is based on the synaptic vesicle cycle that is regulated by the coordinated interaction of approximately 400 different proteins. One of the major synaptic vesicle proteins is synaptophysin (SYP), a member of the tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs). It is likely implicated in various aspects of exo- and endocytosis. The aim of the project was to identify interaction partners of SYP to contribute to the molecular understanding of its function in the synaptic vesicle cycle. The split-ubiquitin yeast two-hybrid system, which allows the detection of direct in vivo interaction of membrane proteins, was used to identify SYP binding partners in murine brain. One of strongest interactions were detected for synaptobrevin2 (SYB2), a well-characterized SYP associate. Among the newly detected SYP binding partners were also the TVPs synaptogyrin3 (SYNGR3) and SCAMP1 thereby demonstrating heterophilic interactions between the various TVP-types for the first time and suggesting shared TVP functions. Validation of the interactions found in yeast was done for proteins that may be involved in the synaptic vesicle cycle. SYB2, SYNGR3, SCAMP1, stathmin-like3 (STMN3), rho family GTPase2 (RND2), phospholipid transfer protein, vesicle transport through interaction with t-SNAREs 1B, arfaptin2 and profilin1 co-localized immunohistologically with SYP in the synapse-rich layers of the retina. The SYP/SYB2- and SYP/SYNGR3-complexes could also be co-immunoprecipitated from murine brain-derived synaptosome-lysates and from cDNA-transfected epithelial cells. The inability to detect interactions in the other instances may be due to technical problems such as bond disruption by the detergent- and salt-containing immunoprecipitation buffer. Therefore, fluorescence resonance energy transfer experiments were performed to detect protein-protein interactions in their native membraneous environments. Positive FRET signals were observed for SYP with SYB2, SYP, SYNGR3, SCAMP1, STMN3, RND2 and arfaptin2. Further FRET analyses of SYP mutants showed that the cytoplasmic carboxyterminus is needed for interactions with cytoplasmic and membrane-associated proteins but not for its association with integral membrane proteins. Finally, tyrosine phosphorylation of the cytoplasmic carboxyterminus of SYP and SYNGR3 was detected by FRET using fluorescently-labelled SH2-domains of the src-kinase. Taken together, it is of note that many of the novel SYP interaction partners are involved in lipid metabolism. It is hypothesized that the cytoplasmic carboxyterminus, which can be modified by phosphorylation, recruits these partners in defined lipid protein domains that are involved in the fine tuning of synaptic vesicle endo- and exocytosis.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4029
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-15903
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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