Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4018
Authors: Kropp, Kai Alexander
Title: Bedeutung der viralen IE4-Region für die Genexpression und Replikation des humanen Cytomegalovirus
Online publication date: 5-Feb-2008
Language: german
Abstract: Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein fakultativ-pathogener Erreger, der bei Patienten mit geschwächter oder unausgereifter Immunabwehr schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen kann. Wie alle Herpesviren zeigt das HCMV eine streng koordinierte Expression viraler Gene, die in eine „sehr frühe-“ (IE), „frühe “ (E) und „späte-“ (L) Phase unterteilt werden kann. Die Produkte der IE-Gene IE1 und IE2 sind für die Expression der frühen Gene und somit für die Initiation der viralen DNA-Replikation entscheidend. Sie greifen gleichzeitig in den zellulären Stoffwechsel ein und schaffen damit optimale Vorraussetzungen für die virale Vermehrung. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass HCMV in lytisch infizierten Zellen ein abundantes IE-Transkript von 5 kb (IE4-RNA) exprimierte, dessen Funktion bislang unklar war. Ältere Publikationen deuteten darauf hin, dass die IE4-Genregion an der Transformation eukaryonter Zellen beteiligt sein könnte. Neuere Arbeiten zeigten, dass es sich bei diesem IE4-Transkript um ein metabolisch stabiles Intron handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst geklärt werden, ob die IE4-Genregion ein Protein kodiert. In der Folge sollten mit viralen Deletionsmutanten Hinweise auf die biologische Funktion des IE4-Bereichs erarbeitet werden. Durch Northern Blot Analysen und cDNA-Klonierungsexperimente konnte eine Reihe neuer Spleiß-Varianten der IE4-RNA identifiziert werden. Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, dass diese Transkripte keine längeren offenen Leserahmen enthalten. Zusammen mit bereits publizierten Erkenntnissen, kann aus diesen Ergebnissen mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass die IE4 Region nicht für ein Protein kodiert. Zur Analyse der biologischen Funktion der IE4-Region wurde das DNA-Genom des HCMV gezielt mutagenisiert. Eine phänotypische Analyse der entsprechenden Viren mittels Reportergen-Tests und quantitativer RealTime RT-PCR zeigte, dass einige der Mutanten eine verringerte Expression früher Gene aufwiesen, die mit einer Beeinträchtigung ihrer Replikationsfähigkeit in Fibroblastenkulturen korrelierte. Dabei war die Ausbildung eines Phänotyps jedoch von dem genetischen Hintergrund des verwendeten viralen Ausgangsstammes abhängig. Auffällig war, dass phänotypische Veränderungen nur bei solchen Mutanten sichtbar wurden, die auf der Grundlage des Laborstammes Ad169 des HCMV generiert worden waren. Die nachfolgende Analyse der Ausgangsstämme ergab deutliche Unterschiede in der IE-Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass die IE4-RNA mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht für ein Protein kodiert, aber bei limitierender Expression der essentiellen Regulatoren IE1 und IE2 die frühe lytische Genexpression stimuliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Funktion der IE4-RNA im Rahmen der lytischen Infektion des HCMV dar.
The human cytomegalovirus (HCMV) is an opportunistic pathogen which causes severe diseases in patients with immature or impaired immune system. Like all herpesviruses the HCMV shows a strictly coordinated expression of viral genes which can be divided in the three phases of immediate early (IE), early (E) and late (L) gene expression. The gene products of the IE-genes IE1 and IE2 are essential factors for the expression of early genes and therefore also for the initiation of viral DNA-Synthesis. At the same time they affect the cellular metabolism to create optimal conditions for viral replication. At the outset of this work it was known that HCMV expressed an abundant 5 kb IE-transcript (IE4-RNA) in lytically infected cells with a yet unknown function. Former publications implicated that the IE4-RNA might play a role in transformation of eukaryotic cells. In more recent publications it was shown that the IE4-RNA is a metabolic stable intron. Within the scope of this thesis the question was addressed, whether the IE4-region coded for a protein or not. Following that IE4-deletion mutants were used to gain information about the biological function of the IE4-gene region. By Northern Blot analysis and cDNA-cloning several new splice-variants of the IE4-RNA were identified. By sequence analysis it was shown that these alternative splicing events did not lead to the production of ORFs coding for more than 100 amino acids. Together with publications of others these data imply with high probability that the IE4-gene region does not code for a protein. In addition the HCMV-genome was subjected to directed mutagenesis to analyse the biological function of the IE4-gene region. Analysis of the IE4-deletion mutants by reportergen-assay and quantitative real-time RT-PCR showed a reduced E gene expression that correlated with an impaired replication in human foreskin fibroblasts. In these experiments the development of a phenotype seemed to be depending on the genetic background of the parental strain. It is particular noticeable that only mutants with an Ad169 background showed phenotypic changes. The used parental strains showed striking differences in the IE-gene expression in a following analysis. The results of this work show therefore that it is quite unlikely for the IE4-region to encode a protein but that it affects E-gene expression in lytically infected cells while IE1 and IE2 expression is limiting. The results of this work provide the prerequisites for further investigations of the molecular mechanisms of the IE4-RNA in lytically infected cells.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4018
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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