Authors:	Brüchert, Wolfram
Title:	Entwicklung einer Online-Kopplung der Gelelektrophorese mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie und deren Anwendung in der Bioanalytik
Online publication date:	15-Jan-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Die Elementmassenspektrometrie wurde in den letzten Jahren sehr erfolgreich zur Aufklärung verschiedener Fragestellungen in der Bioanalytik eingesetzt. Hierbei spielen vor allem Kopplungstechniken von Trennmethoden wie der Flüssigchromatographie (LC) oder der Kapillarelektrophorese (CE) mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) als Multielementdetektor mit hervorragenden Quantifizierungseigenschaften eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von Biopolymeren und deren Wechselwirkung mit verschiedenen Metallen. So wurden beispielsweise verschiedene Methoden für die Trennung und Detektion von Metalloproteinen oder DNA-Metall-Addukten in unterschiedlichen Probenmaterialien entwickelt. Die traditionelle und leistungsstärkste Trennmethode für Biopolymere aller Art, die Gelelektrophorese, wurde jedoch bislang nicht in einem Online-Verfahren an die ICP-MS gekoppelt, um solche Fragestellungen zu bearbeiten. Verschiedene Versuche auf der Basis der Laserablation wurden in diese Richtung unternommen, wobei diese Techniken als sehr umständlich und zeitaufwändig anzusehen sind. In dieser Arbeit wird erstmals die technische Realisierung einer Online-Kopplung der Gelelektrophorese mit der ICP-MS beschrieben. Das System basiert auf einem Prinzip aus der präparativen Gelelektrophorese, in welcher eine kontinuierliche Elution der getrennten Komponenten aus dem Gel während der laufenden Elektrophorese durchgeführt wird. Die eluierten Komponenten werden mit dem Elutionspuffer direkt in das Zerstäubersystem des ICP-MS geführt. Die ersten Untersuchungen wurden am Beispiel der Fragemente von doppelsträngiger DNA (dsDNA) durchgeführt. Kommerziell erhältliche Standardlösungen wurden mit der Online-GE-ICP-MS mittels Detektion von 31P an einem hochauflösenden Massenspektrometer mit einer Massenauflösung von 4000 analysiert. Die Trennbedingungen (z.B. pH-Wert oder Ionenstärke der Pufferlösungen) wurden für die Trennung von dsDNA-Fragementen in Agarosegelen optimiert und auf verschiedene dsDNA-Fragmente angewandt. In einem nächsten Schritt wurden die Quantifizierungsmöglichkeiten für Biopolymere untersucht. Sehr kleine Mengen an dsDNA konnten mit einer Präzision von weniger als 3% quantifiziert werden. Hierfür kamen verschiedene Möglichkeiten der externen Kalibration zum Einsatz, wie der Kalibration mit einem Phosphat-Standard oder einem kommerziell erhältlichen quantitativen dsDNA-Standard. Um das Potenzial der entwickelten Methode für die Untersuchung von Biopolymer-Metall-Wechselwirkungen zu demonstrieren, wurden Oligonukleotide mit Cisplatin unter physiologischen Bedingungen inkubiert und die Reaktionsprodukte mit der Online-GE-ICP-MS mittels 31P- und 195Pt-Detektion untersucht. Verschiedene Cisplatin-Oligonukleotid-Addukte konnten auf diese Weise beobachtet werden, was zur Identifizierung die Anwendung der MALDI-TOF-MS als komplementärer Form der Massenspektrometrie notwendig machte. Abschließend wurde die Isotopenverdünnungsanalyse zum Zweck der Quantifizierung herangezogen. The use of elemental mass spectrometry was successfully applied to different questions in biological and medical research in the last few years. At this the online coupling of powerful separation methods like liquid chromatography (LC) or capillary electrophoresis (CE) to inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) with its excellent mulitelement detection and quantification capabilities gained great importance in the determination of biopolymers and their interaction with metals. Different methods were developed for the separation and detection of metalloproteins or DNA metal adducts in various samples. However, the most popular and powerful separation method for biopolymers, the gel electrophoresis, was not coupled online to ICP-MS fur such studies at this time. Several approaches have been developed on the basis of laser ablation, but this technique is quite laborious and time-consuming, so easier approaches are highly desirable. In this work the technical realisation of an online coupling of gel electrophoresis to ICP-MS is described for the first time. The system bases on the principle of preparative GE, which uses a continuous elution of the separated compounds from the gel. The eluted compounds are directly transferred into the elution buffer, which accomplishes the transport to the nebulisation system of the ICP-MS. The first investigations were done on the example of double-stranded DNA (dsDNA) fragments. Commercially available standard solutions were analysed with online GE-ICP-MS by monitoring 31P with a double-focussing mass spectrometer at a mass resolution of 4,000. Separation conditions (e.g. pH and ionic strength of the buffer) were optimised for agarose gels and applied to different DNA ladders. In the next step the quantification capabilities for biopolymers were studied. Very small amounts of dsDNA can be quantified with a precision lower than 3%. Different approaches are tested using external calibration by phosphate standards as well as by a commercially available quantitative dsDNA standard. To show the potential of the developed system to study interactions of biopolymers and metals, oligonucleotides were incubated with cisplatin under physiological conditions and the reaction products were monitored via 31P and 195Pt with the GE-ICP-MS system. Different cisplatin oligonucleotide adducts can be monitored, what leads to the use of MALDI-TOF-MS as a complementary mass spectrometric method for identification. Finally isotope dilution technique was applied for quantification purposes.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4007
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-15384
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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