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Authors: Seckert, Christof
Title: Die Leber als Latenzort des murinen Cytomegalovirus: Identifizierung und Charakterisierung des latent infizierten Zelltyps
Online publication date: 15-Jan-2008
Language: german
Abstract: Die Untersuchungen der murinen Cytomegalovirus (mCMV) Infektion im BALB/c Mausmodell konzentrierten sich bislang auf die Lunge, da diese einen Hauptort der mCMV Latenz darstellt. Da latentes CMV auch häufig durch Lebertransplantationen übertragen wird, wurde in dieser Arbeit die Leber als ein weiteres medizinisch relevantes Organ der CMV Latenz und Reaktivierung untersucht. Um zunächst die zellulären Orte der mCMV Latenz in der Leber zu ermitteln, wurden verschiedengeschlechtliche Knochenmarktransplantationen (KMT) mit männlichen tdy-positiven Spendern und weiblichen, tdy-negativen Empfängern, mit anschließender mCMV Infektion durchgeführt, um latent infizierte Mäuse mit geschlechtschromosomalem Chimärismus zu generieren. Diese Chimären erlaubten eine Unterscheidung zwischen tdy-positiven Zellen hämatopoetischen Ursprungs und tdy-negativen stromalen und parenchymalen Gewebszellen. Die Separation von Leberzellen der Chimären mittels zentrifugaler Elutriation und anschließender DNA Quantifizierung viraler und zellulärer Genome durch eine quantitative real-time PCR ergab einen ersten Hinweis, dass Endothelzellen ein zellulärer Ort der mCMV Latenz sind. Die darauf folgende immunomagnetische Zelltrennung lokalisierte latente virale DNA in der CD31-positiven Zellfraktion. Die Koexpression von CD31 mit dem endothelzellspezifischen Oberflächenmarker ME-9F1 identifizierte die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSEC) als die Zellen, die latente virale DNA beherbergen. In den zytofluorometrisch aufgereinigten CD31+/ME-9F1+ LSEC waren bei gleichzeitigem Rückgang der männlichen tdy Markergene virale Genome angereichert, was darauf hinwies, dass Zellen, die virale DNA enthalten, vom Knochenmark-Empfänger stammen. Durch zytofluorometrische Analysen isolierter LSEC konnte eine vom Spender abstammende Subpopulation MHCII+/CD11b+ LSEC identifiziert werden. Anschließende Quantifizierungen viraler DNA aus latent infizierten Mäusen detektierten eine Abnahme viraler Genome mit zunehmender Menge an tdy-positiven Zellen, was beweist, dass MHCII+/CD11b+ LSEC keinen Ort der mCMV Latenz darstellen. Die limiting dilution Untersuchungen der isolierten latent infizierten LSEC ergaben eine Frequenz von einer latent infizierten Zelle unter ~1,9x104 LSEC und eine Anzahl von 7 bis 19 viralen Genomen pro latent infizierter Zelle. Nach 24 Stunden Kultivierung der LSEC konnte mittels quantitativer real-time RT-PCR mit Gesamt-RNA aus LSEC ein Anstieg der Genexpression der immediate early Gene ie1 und ie3 sowie eine Induktion des early Gens e1 gezeigt werden. Eine Erhöhung der transkriptionellen Reaktivierung durch die Inkubation der LSEC mit unterschiedlichen HDAC Inhibitoren konnte allerdings nicht erzielt werden, da sowohl die Menge der isolierten RNA aus behandelten Kulturen, als auch die Anzahl viraler Transkripte im Vergleich zu den unbehandelten Kulturen erniedrigt war. Aufgrund der kurzen Lebensdauer isolierter LSEC in vitro konnte durch Kokultivierungen latent infizierter LSEC zusammen mit murinen embryonalen Fibroblasten keine Virusreaktivierung induziert werden. Im Gegensatz dazu wurden durch den Transfer gereinigter ME-9F1+/CD31+ LSEC aus latent infizierten Spendern in immunsupprimierte Empfänger virale Rekurrenzen in Lungenexplantatkulturen des Rezipienten detektiert. Damit konnten LSEC eindeutig als zellulärer Ort von mCMV Latenz und Reaktivierung in der Leber identifiziert werden.
Studies in a BALB/c mouse model of murine cytomegalovirus (mCMV) infection were so far focussed on the lungs as a recognized major organ site of latency. As latent CMV is frequently transmitted also by liver transplantation, investigation of the liver as another potential medically relevant organ site of CMV latency and reactivation was performed. To identify the cellular site of latent mCMV in the liver, sex-mismatched bone marrow transplantations (BMT) with male tdy-positive donors and female tdy-negative recipients receiving an mCMV infection after BMT were performed to generate latently infected sex chromosome chimeras. These sex-mismatched chimeras allow a discrimination between tdy-positive cells of hematopoietic lineages and tdy-negative stromal and parenchymal tissue cells. Separation of liver cells by centrifugal elutriation followed by viral and cellular DNA quantification with quantitative real-time PCR gave a first hint to suggest endothelial cells (EC) as a cellular site of mCMV latency in the liver. Subsequent positive immunomagnetic cell sorting localized latent viral DNA in a CD31-positive cell fraction. Coexpression of CD31 and the endothelial cell type-specific surface marker ME-9F1 identified liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) as cells harbouring latent viral DNA. Specifically, viral genomes were found to be enriched in sort-purified CD31+/ME-9F1+ LSEC concomitant with a loss of the male marker gene tdy, indicating that cells containing viral DNA are recipient-derived. FACS analysis of isolated LSEC from latently infected mice revealed a donor derived subpopulation of MHCII+/CD11b+ LSEC. Subsequent quantification of viral DNA detected a decreased number of viral genomes in an increased quantity of tdy-positive cells, suggesting that MHCII+/CD11b+ LSEC are not a site of mCMV latency. Limiting dilution assays of isolated latently infected LSEC revealed a frequency of one latently infected cell among ~1.9x104 LSEC and a latent viral genome copy number of 7 to 19 per latently infected cell. Quantitative real-time RT-PCR with total RNA from LSEC showed an increased expression of the immediate early genes ie1 and ie3 and an induction of the early gene e1 after 24 hours of LSEC cultivation. However, the application of different HDAC inhibitors to cultured LSEC to induce the enhancement of viral transcriptional reactivation failed, because of a decreased amount of isolated RNA from LSEC and a severe reduction of detectable viral transcripts. Due to the abbreviated life of isolated LSEC in vitro, cocultivation of LSEC from latently infected mice and murine embryonal fibroblasts did not induce any viral reactivation. Finally, transfer of purified ME-9F1+/CD31+ LSEC from latently infected donors into γ-irradiated recipients followed by the detection of virus recurrence in organ explant cultures of the lung identified LSEC as a cellular site of mCMV latency and reactivation.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4006
URN: urn:nbn:de:hebis:77-15370
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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