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Authors: Haberkamp, Mark
Title: Zur Evolution des Cytoskeletts beim Sibirischen Stör Acipenser baeri
Online publication date: 1-Jan-2002
Language: german
Abstract: Im Rahmen meiner Arbeit wurden erstmals die Intermediärfilament-Proteine (IF-Proteine) des Sibirischen Störs Acipenser baeri (Strahlenflosser, Knorpelganoid) kloniert und sequenziert. Aus einer cDNA-Bank konnten die Sequenzen von 13 IF-Proteine gewonnen werden. Von insgesamt zehn Keratinen codieren sieben für Typ I-Keratine und drei für Typ II. Zusätzlich konnten noch Desmin, Vimentin und ein Lamin identifiziert werden. Je einem Typ I- (K13) und einem Typ-II-Keratin (K2) fehlen wenige Aminosäuren in der Head-Domäne.Cytoskelett-Präparationen aus Epidermis, Mitteldarm, Magen und Kieme wurden mittels 2D-PAGE aufgetrennt. Durch Einsatz des CKBB-Test und Immunoblots wurden die verschiedenen Typ I und II-Keratine sowie Desmin und Vimentin identifiziert. Die gewebsspezifische Expression der Keratine ermöglichte zumeist ihre Einteilung in 'E' (epidermal) und 'S' ('simple epithelial').Die MALDI-MS-Analyse einer 2D-PAGE-Koelektrophorese von Seitenflosse und Mitteldarm zeigte, daß die 34 vorhandenen Proteinflecke auf nur 13 verschiedene IF-Proteine zurückgehen. Neun dieser Flecke konnten Sequenzen zugewiesen werden. Zusammen mit den verbleibenden vier Proteinflecken ergeben sich für den Stör nunmehr insgesamt 17 bekannte IF-Proteine. Von drei biochemisch identifizierten IS-Keratinen kommt eines nur im Mitteldarm vor und nur einem konnte eine Sequenz zugeordnet werden (K18). Dem einzigen Typ IIS-Keratin konnte keine Sequenz zugeordnet werden, wahrscheinlich handelt es sich um dabei um das K8-Orthologe. Jedem der fünf Typ IE-Proteine konnte eine Sequenz zugeordnet werden (K10 bis K14), ebenso wie dem einzigen identifizierten Typ IIE-Keratin (K2). Von den Typ III-Proteinen wurden Desmin und Vimentin ihren Proteinflecken zugeordnet. Die nicht zugeordnete Sequenz aba-k1 codiert möglicherweise für ein IIE-Keratin, während aba-k15 vermutlich die Sequenz für ein IE-Keratin enthält. Bei den Proteinflecken, denen eine Sequenz zugeordnet werden konnten, kann für Aba-K2 die Zugehörigkeit zum IIE-Typ angenommen werden, während es sich bei Aba-K10 wahrscheinlich um ein IE-Keratin handelt.Durch Datenbankvergleiche und molekulare Stammbäume konnte die Zugehörigkeit der identifizierten Lamin-Sequenz zum B3-Subtyp der Vertebraten gezeigt werden.Die Daten der Biochemie und indirekten Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen, daß Keratine in Epithelien und Vimentin in mesenchymalen Geweben vorkommen. Es existieren starke Hinweise, daß im letzten Gewebetyp Keratine auch koexprimiert werden. Desmin kommt in großen Mengen im Magen und im Mitteldarm vor und stellt dort das prominenteste Protein.Mit den gewonnenen Sequenzdaten wurden molekulare Stammbäume und Sequenzidentitäten berechnet. Die daraus resultierenden Konsequenzen für die Verwandtschaftsverhältnisse der verschiedenen IF-Proteine sowie der Wirbeltiere werden diskutiert.
During my work intermediate filament-proteins (IF-proteins) of the Siberian Sturgeon Acipenser baeri (ray-finned fish; chondrostei) were cloned and sequenced for the first time. From a cDNA-Bank 13 different sequences of IF-proteins were isolated. Ten of them coded for keratins: seven type-I and three type-II-keratins. Additionally, desmin, vimentin and one lamin were identified. One type I- (K13) and one type II-keratin (K2) have some amino acids missing in the tail-domain.Preparations of the cytoskeleton from epidermis, midgut, stomach and gill were revealed by 2D-PAGE. The different keratin-types and desmin, as well as vimentin, were identified by using the CKBB-test and immunblots. In general, the tissue specific expression allowed characterization as 'E' (epidermal) and 'S' (simple epithelial) keratins.The 34 different protein spots of a 2D-PAGE co-electrophoresis from vertical fin and midgut were traced back to only 13 different IF-proteins. Sequences could be assigned only to nine of them. Together with the four remaining protein spots there are now 17 different IF-proteins known for Acipenser.One of the three biochemically identified IS-keratins appears only in midgut and only one could be assigned to a sequence (K18). The one known type IIS-keratin could not be assigned to a sequence, but it is likely to be the K8-ortholog in Acipenser. A sequence could be assigned to each of the five different type IE-keratins (K10 to K14) as well as to the only known type IIE-keratin (K2). The type III-proteins desmin and vimentin were also assigned to their protein spots. The assigned sequence aba-k1 possibly codes for a type IIE-keratin, whereas aba-k15 most likely codes for an IE-keratin. Aba-K2, a protein without an assigned sequence, probably represents a type IIE-protein, whereas Aba-K10 could be an IE-keratin.The identified lamin was assigned to the vertebrate B3-subtype, by comparison with databanks and phylogenetic trees.Biochemical and indirect immunfluorescence data demonstrate the expression of keratins in epithelia and vimentin in mesenchymally derived tissues; there is strong evidence for keratin coexpression in the latter. Desmin can be found in large quantities in stomach and midgut and therefore represents the most prominent IF-protein in this tissue.From the derived sequences, phylogenetic trees and sequence identities were calculated. The relationship of Acipenser IF-proteins to those of other vertebrates were compared and discussed.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3965
URN: urn:nbn:de:hebis:77-3758
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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