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Authors: Bohn, Rebecca
Title: Canonical and non-canonical autophagy modulation in human primary macrophages and its effect on the adaptive immune system
Online publication date: 14-May-2017
Language: english
Abstract: In this study we focused on the modulation of autophagy mechanisms in human monocyte derived macrophages (hMDM) focusing on (i) modulation of autophagy in pro- (hMDM-1) and anti-inflammatory (hMDM-2) macrophages as prototypic immunomodulatory cells, (ii) the role of autophagy in antigen processing and presentation, (iii) the impact of the Leishmania virulence factor GP63 on the host cells’ autophagy machinery and adaptive immunity and (iv) LC3-associated phagocytosis (LAP) as immune evasion mechanism for Leishmania. Autophagy in hMDM-1 and hMDM-2 was induced by the chemicals Rapamycin, AZD8055 and PI-103 as well as by the peptide Tat-Beclin. In general, hMDM-2 were more susceptible for autophagy induction. Autophagy inhibition was achieved by Spautin-1 and Wortmannin treatment in both phenotypes and with LY294002 only in hMDM-1. Using RNA interference to achieve autophagy inhibition, a time- and target-dependent efficiency of protein reduction was observed. Interestingly, autophagy could be induced independently of ULK-1 and Beclin-1 in hMDM-1. Autophagy modulation in hMDM had no impact on Tetanus Toxoid induced T cell proliferation. Surprisingly, we found hMDM-2 to be superior to hMDM-1 in activating lymphocytes. Proteome and surface marker analysis revealed higher expression of proteins being involved in antigen processing and presentation in hMDM-2. Based on the hypothesis that apoptotic Leishmania (Lm) induce the non-canonical autophagy pathway LAP resulting in a reduced T cell proliferation, we aimed to modulate LAP and analyzed the effect on the adaptive immune response. Replacing apoptotic parasites by LAP inducing stimuli such as zymosan and phosphatidylserine coated beads suppressed the Leishmania induced T cell proliferation and consequently enhanced intracellular parasite survival. Analyzing the underlying mechanisms of LAP in hMDM, inhibition of the NADPH oxidase by DPI blocked LAP induction. In addition, infection of hMDM with Staurosporine-treated Lm, being ROS positive, increased LC3 conversion which suggests ROS-dependent LAP induction in hMDM. Infection with apoptotic Lm and zymosan leads to enhanced phagolysosomal acidification, which might be a potential mechanism for altered antigen processing resulting in a reduced T cell proliferation. In conclusion, these data provide a better understanding of autophagy in hMDM being a potential immune evasion mechanism for Leishmania. The obtained results may contribute in the development of safe and efficient therapeutic interventions in humans for the treatment of autophagy-related diseases.
In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf die Modulation von Autophagie Mechanismen in humanen primären Makrophagen (hMDM) und untersuchten dabei folgende Punkte: (i) Modulation von Autophagie in pro- (hMDM-1) und anti-inflammatorischen (hMDM-2) Makrophagen als prototypische immunmodulierende Zellen, (ii) die Rolle von Autophagie für Antigen-Prozessierung und -Präsentation, (iii) den Einfluss des Leishmanien Virulenzfaktors GP63 auf den Autophagieprozess der Wirtszelle und die adaptive Immunantwort und (iv) LC3-assoziierte Phagozytose (LAP) als Ausweichmechanismus für Leishmanien vor dem Immunsystem. Autophagie konnte mit den Chemikalien Rapamycin, AZD8055 und PI-103 als auch mit dem Peptid Tat-Beclin in hMDM-1 und hMDM-2 induziert werden. Generell zeigten hMDM-2 eine stärkere Autophagie Induktion. Inhibition wurde durch Behandlung mit Spautin-1 und Wortmannin in beiden Phenotypen und mit LY294002 nur in hMDM-1 erreicht. Mit Hilfe von RNA Interferenz zur Autophagie Inhibition wurde eine Zeit- und Target-abhängige Proteinreduktion beobachtet. Interessanterweise konnte Autophagie unabhängig von ULK-1 und Beclin-1 in hMDM-1 induziert werden. Die Modulation von Autophagie hatte keinen Einfluss auf die Tetanus Toxoid induzierte T Zell Proliferation. Überraschenderweise zeigten hMDM-2 eine bessere Aktivierung von Lymphozyten als hMDM-1. Proteom- und Oberflächenmarker-Analyse wiesen auf eine höhere Expression von Proteinen, die an der Antigen-Prozessierung und -Präsentation beteiligt sind, in hMDM-2 hin. Basierend auf der Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den nicht-kanonischen Autophagie-Mechanismus LAP induzieren was zu reduzierter T Zell Proliferation führt, modulierten wir LAP und analysierten den Effekt auf die adaptive Immunantwort. Das Ersetzen von apoptotischen Parasiten durch LAP-induzierende Stimuli wie Zymosan und phosphatidylserin-beschichtete Partikel unterdrückte die Leishmanien-induzierte T Zell Proliferation und erhöhte das intrazelluläre Überleben der Parasiten. Die Analyse der zugrundeliegenden Mechanismen zeigte, dass die Inhibition der NADPH Oxidase durch DPI die Induktion von LAP in hMDM blockierte. Weiterhin resultierte die Infektion von hMDM mit Staurosporin-behandelten Leishmanien, die ROS positiv sind, in einer erhöhten LC3 Konversion, die eine ROS-abhängige Induktion von LAP in hMDM suggeriert. Die Infektion mit apoptotischen Leishmanien und Zymosan führte zu einer verstärkten phagolysosomalen Ansäuerung, die ein potentieller Mechanismus für eine veränderte Antigen-Prozessierung, resultierend in verminderter T Zell Proliferation, sein könnte. IV Abschließend liefern diese Daten ein besseres Verständnis von Autophagie in hMDM welche als möglicher Ausweichmechanismus für Leishmanien vor dem humanen Immunsystem dienen könnte. Die erhaltenen Ergebnisse liefern einen wertvollen Beitrag zur Entwicklung von sicheren und effizienten therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Autophagie-bedingten Krankheiten beim Menschen.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3889
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: VIII, 154 Seiten
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