Authors:	Katharina Schrick
Title:	Regulation der Genexpression des RNA-bindenden Proteins KSRP und dessen Bedeutung für die Pathogenese von chronisch inflammatorischen Erkrankungen
Online publication date:	6-Dec-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	Der Entstehung chronisch entzündlicher Erkrankungen liegt häufig eine Dysregulation der pro-inflammatorischen Genexpression zugrunde. Hierbei spielen posttranskriptionelle Mechanismen, wie die durch RNA-Bindeproteine-vermittelte Modulation der mRNA-Stabilität, eine wichtige Rolle. Das KH-type splicing regulatory protein (KSRP) ist aufgrund seiner Struktur in der Lage, sowohl RNA als auch DNA zu binden und auf mehreren Ebenen in die Genexpression einzugreifen. Dadurch wird für KSRP eine Rolle in der Pathogenese von chronischen Autoimmunerkrankungen, wie z.B. der Rheumatoiden Arthritis (RA), vermutet. Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation der KSRP-Expression sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene aufzuklären, um mögliche Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu identifizieren. Die Charakterisierung der 3 kb langen Sequenz stromaufwärts des Exon 1 hinsichtlich potentieller Promotoraktivität hat gezeigt, dass die Transkription von KSRP scheinbar über mehrere, eng beieinander liegende Promotorabschnitte gestartet werden kann. Dabei spielt vermutlich der Transkriptionsfaktor SP1 eine Rolle, für den eine Interaktion mit dem putativen KSRP Promotor nachgewiesen wurde. Zudem konnte gezeigt werden, dass auf posttranskriptioneller Ebene die annotierte 108 bp lange KSRP 5‘-UTR die Expression über vermutlich translationale Mechanismen begünstigt. Ebenso ist die 3‘-UTR von Bedeutung, die mehrere AU-reiche Elemente enthält und einen negativen regulatorischen Effekt auf die Expression ausübt. Pulldown-Analysen identifizierten unter anderem KSRP selbst als Interaktionspartner der 3'-UTR, was allerdings keinen Einfluss auf die Expression eines Reportergenkonstruktes hatte. Stattdessen wird eine mögliche Autoregulation auf translationaler Ebene über die 5‘-UTR gesteuert. Weiterhin wurde die Rolle von KSRP für die Pathogenese der RA als Beispiel einer chronisch entzündlichen Erkrankung untersucht, wofür das Modell der Kollagen-Antikörper-induzierten Arthritis (CAIA) in KSRP-defizienten (KSRP-ko) Mäusen angewendet wurde. Entgegen den Erwartungen war die Arthritis-Entwicklung in KSRP-ko Tieren schwächer ausgeprägt als in den Kontrollmäusen, was anhand der Pfotenschwellung und mittels mRNA-Analysen nachgewiesen wurde. Histologische Untersuchungen zeigten, dass der Knockout von KSRP eine verringerte Frequenz an eingewanderten Immunzellen, darunter Monozyten, Makrophagen und Neutrophile, in die Gelenke zur Folge hatte. Das kann durch eine erhöhte Apoptoserate der Zellen myeloiden Ursprungs erklärt werden. Letztendlich konnte bestätigt werden, dass die anti-inflammatorischen Effekte des Naturstoffs Resveratrol zumindest zum Teil KSRP-abhängig sind. Dabei wird die Phosphorylierung von KSRP durch die p-38 mitogenaktivierte Proteinkinase verhindert, wodurch die Interaktion zwischen KSRP und mRNAs pro-inflammatorischer Mediatoren, wie TNF-α, IL-8 and iNOS, verstärkt wird. Das resultiert wiederum im beschleunigten Abbau der Transkripte. Chronic inflammatory diseases are often characterized by dysregulation of pro-inflammatory gene expression, which is predominantly controlled at the posttranscriptional level by RNA binding proteins (RNA-BP) via regulation of mRNA stability. The KH-type splicing regulatory protein (KSRP) is a multi-functional protein that influences gene expression at various levels due to its property to bind both, RNA and DNA. Therefore, a role of KSRP is assumed for the development of chronic inflammatory disorders like Rheumatoid Arthritis (RA). The aim of this study was to elucidate the regulation of KSRP expression at transcriptional and post-transcriptional level, as this may be able to develop new anti-inflammatory therapeutic strategies. Characterization and analysis of a 3 kb sequence upstream of KSRP exon 1 concerning potential promoter activity showed, that transcription of KSRP gene seems to be initiated by promoter parts that are located near to each other. The interaction observed between SP1 and the putative KSRP promoter reveals a potential role of SP1 in transcription initiation. Furthermore, the annotated 108 bp 5’-UTR of KSRP promotes expression due to predominantly translational mechanisms. In addition, the 3’-UTR sequence is also important for posttranscriptional regulation. It contains several AU-rich elements as putative binding sites for RNA-BPs and has a negative regulatory effect on KSRP expression. Pulldown analysis identified KSRP itself as an interaction partner of its own 3’-UTR, but there was no effect on expression of a reportergene construct measured in KSRP-deficient cells. A potential autoregulation is rather accomplished by the 5’-UTR via posttranscriptional processes. These data demonstrate that complex mechanisms control KSRP expression. Furthermore, the role of KSRP in RA, as an example for a chronic inflammatory disorder, was investigated. Therefore, collagen antibody-induced arthritis (CAIA) as an appropriate autoimmune disease mouse model was used. Induction of arthritis in KSRP-deficient mice (KSRP-ko) unexpectedly leads to a less severe arthritis induction compared to control mice. This was manifested in a reduced swelling of the paws and reduced mRNA expression of pro-inflammatory mediators (TNF-α, CXCL-1 and iNOS) in joints. Histological hematoxylin and eosin staining identified a lower frequency of immune cells in joints of KSRP-ko mice, including monocytes, macrophages, and neutrophils. This could be explained by an enhanced apoptosis of myeloid cells. Finally, experiments confirmed that the anti-inflammatory effects of resveratrol are at least partially KSRP-dependent. Binding of resveratrol to KSRP prevents KSRP phosphorylation by p38 mitogen-activated protein kinase, which enhances intracellular binding of KSRP to target mRNAs of pro-inflammatory mediators like TNF-α, IL-8 and iNOS. This leads to an accelerated decay of these transcripts.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3849
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000024187
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xxi, 227 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen