Authors:	Fritzsch, Christoph Alexander
Title:	Regulation and cell-to-cell variability of estrogen-dependent transcription
Online publication date:	4-Dec-2018
Language:	english
Abstract:	Transcription is the major control point for the production of cellular components, and as such, it governs fate and function of cells. Surprisingly, this critical step in information transmission is rather unreliable: The low copy-number of molecules controlling transcription, leads to stochastic effects in the production of RNAs. Discontinuities in transcriptional permissiveness of gene promoters, witnessed as “transcriptional bursts”, amplify this effect and lead to variability in gene expression between cells. Furthermore, the cellular state influences the capacity of transcription in a cell-specific manner, hereby affecting transcriptional output on long timescales. Variegated expression can be beneficial in development and cellular decision-making. However, it is also exploited by cancerous tissue, as intra-tumor diversity lowers therapeutic effectiveness. It is essential to study stochastic transcriptional regulation at the single-cell level, to comprehend sources and consequences of cellular heterogeneity in health and disease. This thesis examines how cells control transcriptional bursts to adapt gene expression output to environmental signals and how the cellular state influences this process. An estrogen-sensitive locus served as a model system as it allows for tight experimental control of expression through varying estrogen levels. Fluorescent labeling of nascent transcripts in combination with time-resolved microscopy in living cells enabled quantitative measurements of single-cell transcriptional dynamics. Transcription occurred in stochastically timed bursts with a strong cell-to-cell variability in long-term transcriptional output. Stochastic mathematical models of promoter progression and transcription were fitted to the acquired datasets to discriminate alternative hypotheses of promoter regulation. This revealed that estrogen adjusts the frequency of transcriptional bursts by controlling the transition to a transcriptionally permissive promoter. The cellular state, however, alters longterm transcriptional output through initiation and elongation kinetics. This effect is mediated through a diffusible factor, as two alleles within the same cell were similarly affected and recently divided daughter cells correlated in time-averaged transcription. To infer whether the chromatin environment influences burst characteristics and transcriptional noise, perturbations using inhibitors of chromatin modifying enzymes were performed. Interestingly, the inhibition of histone deacetylation reduced noise in gene expression, highlighting that chromatin permits noise regulation at the level of nascent transcription. In conclusion, this thesis provides a quantitative description of estrogen-dependent transcription, which incorporates transcriptional bursting, the influence of cellular state, and gene-specific tuning through chromatin. Der Prozess der Transkription bestimmt maßgeblich das Schicksal und die Funktionsfä-higkeit einer Zelle, indem er die Produktion zellulärer Bestandteile steuert. Überra-schenderweise ist dieser Schritt der Informationsübertragung nicht sehr zuverlässig: Da die an der Transkription beteiligten Moleküle nur in geringer Anzahl in der Zelle vorliegen, ent-stehen stochastische Effekte bei der Herstellung von RNAs. Diese werden verstärkt durch zeitliche Fluktuationen in der Transkriptionsfähigkeit eines Gens, welche als transkriptionel-le „Bursts“ zu beobachten sind, wodurch sich Genexpressionsmuster von Zelle zu Zelle unterscheiden. Außerdem wirkt sich der interne Zustand einer Zelle auf die zellspezifische Transkriptionsaktivität aus. Die daraus resultierende Expressionsvariabilität kann während der Gewebeentwicklung und der zellulären Entscheidungsfindung vorteilhaft sein. Aller-dings führt die Heterogenität von Krebszellen im Tumorgewebe auch zu einer Beeinträch-tigung des therapeutischen Erfolgs. Die Untersuchung stochastischer Effekte ist daher wichtig, um die Entstehung zellulärer Heterogenität und deren Bedeutung für gesundes sowie krankes Gewebe zu verstehen. In dieser Arbeit wurde zum einen untersucht, wie transkriptionelle Bursts reguliert werden, um Höhe und Variabilität von Geneexpression an Umweltsignale anzupassen und zum an-deren, wie dieser Prozess durch den inneren Zustand der Zelle beeinflusst wird. Dabei wurde ein östrogenabhängiges Gen als Modellsystem gewählt, um eine gezielte Steuerung der Expression durch Änderung der Hormonmenge zu ermöglichen. Naszierende RNAs wurden durch Fluoreszenzmarkierung im Mikroskop sichtbar gemacht und über verschie-dene Zeitpunkte in lebenden Zellen verfolgt. So konnte die dynamische Transkriptionsakti-vität einzelner Zellen und die daraus resultierende Variabilität quantifiziert werden. Tran-skription trat in stochastischen Bursts auf, wobei sich die mittlere Transkriptionsaktivität von Zelle zu Zelle unterschied. Stochastische Modelle, welche die zeitliche Entwicklung des Promotorzustandes und des Transkriptionsprozesses beinhalteten, wurden an die auf-genommenen Daten angepasst und erlaubten es, unterschiedliche Hypothesen der Pro-motorregulation zu testen. Hierbei ergab sich, dass Östrogen die Frequenz transkriptionel-ler Bursts ändert, indem es den Übergang in einen aktiven Promoterzustand reguliert. Der Zellzustand hingegen beeinflusst die Genexpression durch Änderung der Initiations- und Elongationsraten. Dafür ist ein diffundierender Faktor verantwortlich, da sowohl zwei Allele innerhalb derselben Zelle, als auch Tochterzellen nach der Zellteilung in der zeitgemittelten Transkription korrelierten. Um herauszufinden, ob Chromatin die Eigenschaften von Bursts und die resultierende Ex-pressionsvariabilität beeinflusst, wurden chromatinabhängige Prozesse inhibiert. Interes-santerweise reduzierte eine Inhibition der Histondeacetylierung die Variabilität der Genex-pression. Chromatin ermöglicht also eine Regulation der Heterogenität bereits während der Produktion von RNAs. Schlussendlich bietet diese Arbeit eine quantitative Beschreibung östrogenabhängiger Transkription, die sowohl transkriptionelle Bursts und den Einfluss des zellulären Zustands, als auch genspezifische Regulation auf Chromatinebene beinhaltet.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3843
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	in Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	V, 117 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen