Authors:	Mack, Michaela
Title:	Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Bedeutung der endogenen retroviralen Insertion HERV-K(C4) im C4-Gen des Menschen
Online publication date:	3-May-2005
Year of first publication:	2005
Language:	german
Abstract:	Der Längenpolymorphismus des C4-Gens beruht auf der An- oder Abwesenheit einer 6.4 kb langen Insertion im Intron 9. Es handelt sich dabei um einen eigenständigen bisher noch nicht beschriebenen Virus-Typ, der alle Sequenzmerkmale der Familie der humanen endogenen Retroviren (HERV) trägt und zu den HERV-K Viren gehört. Der Provirus wurde als HERV-K(C4) bezeichnet. Die Orientierung dieses retroviralen Elements ist entgegengesetzt zu der Transkriptionsrichtung des C4-Gens. Mittels RT-PCR, RNase Protection Assays und Northern-Blot Analysen konnte der Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense mRNA-Transkripten in verschiedenen humanen Zellinien und Geweben erbracht werden. Die retroviralen Transkripte schlossen am 5'- und 3'-Ende Sequenzen des C4-Exon 9 und Exon 10 ein, so daß diese wahrscheinlich "readthrough" Transkripte darstellen, die durch einen 5' des LTR2 gelegenen Promotor initiiert oder im Zusammenhang mit der C4-Expression transkribiert und reguliert werden. Weiterhin konnten insgesamt 4 HERV-K(C4)-mRNA Spezies, einschließlich einer Vollängen-RNA detektiert werden. Die drei subgenomischen mRNAs werden vermutlich durch einfaches und mehrfaches Spleißen generiert. Die quantitative Analyse in verschiedenen humanen Zellinien ergab, daß HERV-K(C4) durchschnittlich mit einer Kopienanzahl zwischen ca.1 bis 100 Transkripten in einer Zelle vorkommt, so daß es sich um low abundance mRNAs handelt. Mittels eines Reportergen-System konnte eine Aktivität des LTR2-Promotors in der Sense-Orientierung des Retrovirus nachgewiesen werden, die nach Stimulation mit IFN- signifikant abnahm. Ein humanes Modell-Systems wurde etabliert, um die Theorie einer Antisense-Abwehr gegen exogene Retroviren in HepG2-Zellen zu überprüfen. Die Theorie basiert auf dem Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense-Transkripten, die über eine Heteroduplexbildung mit der Sense-mRNA von verwandten, infektiösen Retroviren eine mögliche Blockierung deren Translation erwirken könnten. Es konnte eine signifikante Abnahme der retroviralen Expression von bis zu 45% nach steigenden Dosen an IFN- in HepG2-Zellen nachgewiesen werden. Der funktionell aktive 3'-LTR-Sense Promotor sowie der Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense Transkripten sprechen für die bedeutende Rolle von HERV-K(C4) bei der Genregulation und Schutz gegen exogene Retroviren, wodurch eine Selektion stattgefunden hat. An insertion of 6.4 kb size is present in intron 9 of 60 % of the human complement C4 genes, as well as in the C4 genes of a number of old world primates. This insertion has the typical genomic organization of endogenous retroviruses, with the three major genes gag, pol and env flanked by long terminal repeats (LTRs). This HERV-K(C4) insertion is in reverse orientation to the C4 coding sequence. Using reverse transcription PCR as well as RNAse protection assays and northern blot analysis, retroviral mRNA transcripts could be detected in different human cell lines which were only present in the antisense orientation of the retrovirus. Furthermore, C4 expression as well as intermediate transcripts which demonstrate transcripts longer than the expected full-length size comprising both HERV-K(C4) and C4 coding sequence was observed. They may represent readthroughts into the adjacent C4 gene or initiation of transcripts by a upstream cellular promoter. Four viral mRNA species could identified, including a full-length HERV-K(C4)-mRNA. The other three subgenomic mRNAs are generated by single or multiple splicing events. These findings were confirmed using real time PCR to quantitate the number of specific low abundance HERV-K(C4)-antisense transcripts with 1 to 100 copies per cell. Using reporter gene assays it could be demonstrated that only the 3'LTR exhibits promoter activity but in the sense orientation of the retrovirus. It has been suggested earlier that expression of C4 could lead to the transcription of a retroviral antisense RNA which might protect against exogenous retroviral infections. In a previous study it was shown that the expression of retroviral-like constructs was significantly downregulated in mouse cells transfected with human C4 genes and that this downregulation was further modulated after IFN- stimulation of C4 expression. In a new series of experiments, we have now confirmed these observations using human hepatoma cells constitutively expressing C4. A dose-dependent downregulation of up to 45% caused by hybridization of retroviral sense and genomic HERV-K(C4) antisense RNA was observed. The functional 3' LTR promotor, the presence of retroviral antisense RNA transcripts and the functional detection of HERV-K(C4)-specific antisense activity provide strong evidence for a major role of the HERV-K(C4) insertion in the control of gene expression resulting in a selective advantage favouring the presence of this element in human and primate C4 genes.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3792
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-7410
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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