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Authors: Storf, Stefanie
Title: Untersuchung der Pigment- und Proteinzusammensetzung der peripheren Lichtsammelantenne des Photosystem I
Online publication date: 11-Apr-2005
Language: german
Abstract: Die Lichtsammelantenne des PSI (LHCI) ist hinsichtlich ihrer Protein- und Pigmentzusammensetzung weniger gut untersucht als die des PSII. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb zunächst die Isolation von nativen LHCI-Subkomplexen optimiert und deren Pigmentzusammensetzung untersucht. Zusätzlich wurde die Pigmentbindung analysiert sowie das Pigment/Protein-Verhältnis bestimmt. Die Analyse der Proteinzusammensetzung des LHCI erfolgte mittels einer Kombination aus ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese mit Westernblotanalysen mit Lhca-Protein-spezifischen Antikörpern und massenspektrometrischen Untersuchungen. Dabei stellte sich heraus, dass der LHCI mehr Proteine bzw. Proteinisoformen enthält als bisher vermutet. So gelang durch die massenspektrometrischen Untersuchungen die Identifizierung zweier bisher noch nicht nachgewiesener Lhca-Proteine. Bei diesen handelt es sich um eine Isoform des Lhca4 und ein zusätzliches Lhca-Protein, das Tomaten-Homolog des Lhca5 von Arabidopsis thaliana. Außerdem wurden in 1D-Gelen Isoformen von Lhca-Proteinen mit unterschiedlichem elektrophoretischen Verhalten beobachtet. In 2D-Gelen trat zusätzlich eine große Anzahl an Isoformen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten auf. Es ist zu vermuten, dass zumindest ein Teil dieser Isoformen physiologischen Ursprungs ist, und z.B. durch differentielle Prozessierung oder posttranslationale Modifikationen verursacht wird, wenn auch die Spotvielfalt in 2D-Gelen wohl eher auf die Probenaufbereitung zurückzuführen ist. Mittels in vitro-Rekonstitution mit anschließenden biochemischen Untersuchungen und Fluoreszenzmessungen wurde nachgewiesen, dass Lhca5 ein funktioneller LHC mit spezifischen Pigmentbindungseigenschaften ist. Außerdem zeigten in vitro-Dimerisierungsexperimente eine Interaktion zwischen Lhca1 und Lhca5, wodurch dessen Zugehörigkeit zur Antenne des PSI gestützt wird. In vitro-Dimerisierungsexperimente mit Lhca2 und Lhca3 führten dagegen nicht zur Bildung von Dimeren. Dies zeigt, dass die Interaktion in potentiellen Homo- oder Heterodimeren aus Lhca2 und/oder Lhca3 schwächer ist als die zwischen Lhca1 und Lhca4 oder Lhca5. Die beobachtete Proteinheterogenität deutet daraufhin, dass die Antenne des PSI eine komplexere Zusammensetzung hat als bisher angenommen. Für die Integration „neuer“ LHC in den PSI-LHCI-Holokomplex werden zwei Modelle vorgeschlagen: geht man von einer festen Anzahl von LHCI-Monomeren aus, so kann sie durch den Austausch einzelner LHC-Monomere erreicht werden. Als zweites Szenario ist die Bindung zusätzlicher LHC vorstellbar, die entweder indirekt über bereits vorhandene LHC oder direkt über PSI-Kernuntereinheiten mit dem PSI interagieren. In Hinblick auf die Pigmentbindung der nativen LHCI-Subfraktionen konnte gezeigt werden, dass sie Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie und Anzahl binden, und sich vom LHCIIb vor allem durch eine verstärkte Bindung von Chlorophyll a, eine geringere Anzahl von Carotinoiden und die Bindung von ß-Carotin an Stelle von Neoxanthin unterscheiden. Der Vergleich von nativem LHCI mit rekonstituierten Lhca-Proteinen ergab, dass Lhca-Proteine Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie binden, und dass sie Carotinoidbindungsstellen mit flexiblen Bindungseigenschaften besitzen. Auch über die Umwandlung des an die einzelnen Lhca-Proteine gebundenen Violaxanthins (Vio) im Xanthophyllzyklus war nur wenig bekannt. Deshalb wurden mit Hilfe eines in vitro-Deepoxidationssystems sowohl native als auch rekonstituierte LHCI hinsichtlich ihrer Deepoxidationseigenschaften untersucht und der Deepoxidationsgrad von in vivo deepoxidierten Pigment-Protein-Komplexen bestimmt. Aus den Deepoxidationsexperimenten konnte abgeleitet werden, dass in den verschiedenen Lhca-Proteinen unterschiedliche Carotinoidbindungsstellen besetzt sind. Außerdem bestätigten diese Experimente, dass der Xanthophyllzyklus auch im LHCI auftritt, wobei jedoch ein niedrigerer Deepoxidationsgrad erreicht wird als bei LHCII. Dies konnte durch in vitro-Deepoxidationsversuchen auf eine geringere Deepoxidierbarkeit des von Lhca1 und Lhca2 gebundenen Vio zurückgeführt werden. Damit scheint Vio in diesen Lhca-Proteinen eher eine strukturelle Rolle zu übernehmen. Eine photoprotektive Funktion von Zeaxanthin im PSI wäre folglich auf Lhca3 und Lhca4 beschränkt. Damit enthält jede LHCI-Subfraktion ein LHC-Monomer mit langwelliger Fluoreszenz, das möglicherweise am Lichtschutz beteiligt ist. Insgesamt zeigten die Untersuchungen der Pigmentbindung, der Deepoxidierung und der Fluoreszenzeigenschaften, dass sich die verschiedenen Lhca-Proteine in einem oder mehreren dieser Parameter unterscheiden. Dies lässt vermuten, dass schon durch leichte Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des LHCI eine Anpassung an unterschiedliche Licht-verhältnisse erreicht werden kann.
The aim of this work was to investigate the pigment binding properties and the protein composition of the outer light-harvesting antenna (LHC) of photosystem I (PSI) which in contrast to the light harvesting antenna of PSII has been much less investigated so far. The analysis of the protein composition using one- and two-dimensional gelelectrophoresis in combination with western blot experiments and mass-spectrometry revealed a heterogeneous protein composition of LHCI. Mass-spectrometry allowed the identification of two additional Lhca-proteins (Lhca5 and a second isoform of Lhca4). Spectroscopic and biochemical investigations of in vitro reconstituted Lhca5 showed that Lhca5 is able to form a functional light-harvesting complex which interacts with Lhca1 thus confirming its nature as a component of LHCI. In addition isoforms of Lhca-proteins with different apparent molecular weight and different isoelectric points were separated by one- and two-dimensional gelelectrophoresis. It is assumed that at least part of these isoforms originate from post-translational modifications or differential processing although the spot heterogeneity in two-dimensional gels might as well be due to the preparation procedure. In summary the protein heterogeneity and the presence of additional LHCI components implies that the light-harvesting antenna of PSI is more flexible than is usually assumed. There are two ways how the new proteins might be incorporated into the PSI-LHCI-holocomplex: either one of the “normal” LHC-monomers is exchanged against one of the new proteins, or an additional layer of LHC-monomers is added. The pigment-binding of LHCI was shown to differ from that of LHCIIb in that it has a higher Chl a content and binds less carotenoids. In addition ß-carotene is bound by LHCI instead of neoxanthin in LHCIIb. The comparison of native LHCI and in vitro reconstituted Lhca-monomers revealed flexible carotenoid-binding properties. In vitro de-epoxidation experiments indicated that in different Lhca-proteins different binding-sites might be involved in carotenoid-binding. These experiments also showed that violaxanthin bound to LHCI is involved in the xanthophyll cycle, although to a lesser extent than violaxanthin bound to LHCII. And it was shown that the different Lhca-proteins exhibit different de-epoxidation behaviours and thus may be involved in photo-protection to different extents. Summarizing the differences in pigment-binding of single Lhca-proteins implies that changing the protein composition of LHCI might allow a relatively fast adaption to different environmental conditions.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3781
URN: urn:nbn:de:hebis:77-7240
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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