Authors:	Prinzen, Claudia
Title:	Genomische Struktur und Promotorcharakterisierung des humanen ADAM10-Gens
Online publication date:	12-Apr-2005
Year of first publication:	2005
Language:	german
Abstract:	Das ADAM10-Gen kodiert für eine membrangebundene Disintegrin-Metalloproteinase, die das Amyloidvorläuferprotein spaltet. Im Mausmodell konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von ADAM10 die Plaquebildung vermindern und das Langzeitgedächtnis verbessert. Aus diesem Grund ist es für einen möglichen Therapieansatz für die Alzheimer’sche Erkrankung erforderlich, die Organisation des humanen ADAM10-Gens und seines Promotors aufzuklären. Beim Vergleich der genomischen Sequenzen von humanem und murinem ADAM10 zeigte sich eine hohe Übereinstimmung. Beide Gene umfassen 160 kbp und bestehen aus 16 Exons. Die ersten 500 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt zwischen dem Menschen, der Maus und der Ratte sind hoch konserviert. Diese Region beinhaltet spezifische regulatorische Elemente, die die ADAM10-Transkription modulieren. In den ersten 2179 bp stromaufwärts vom humanen ADAM10-Translationsstartpunkt fanden sich einige potentiellen Transkriptionsfaktor-bindungsstellen (Brn-2, SREBP, Oct-1, Creb1/cJun, USF, Maz, MZF-1, NFkB und CDPCR3HD). Es wurde eine charakteristische GC-Box und eine CAAT-Box, aber keine TATA-Box identifiziert. Nach Klonierung dieser 2179 bp großen Region wurde eine starke Promotoraktivität, insbesondere in neuronalen Zelllinien, gefunden. Bei der Analyse von Deletionskonstrukten wurde die Region zwischen -508 und -300 als essentiell für die Transkriptionsaktivierung bestimmt. Die Promotoraktivität wird zudem streng herunterreguliert, wenn in die Region 317 bp stromaufwärts vom Startpunkt der Translation eine Punktmutation eingeführt wird. Diese per Computeranalyse als USF-Bindungsstelle deklarierte Region spielt eine zentrale Rolle bei der ADAM10-Transkription. Im EMSA wurde eine Protein-DNA-Interaktion für diese Region gezeigt. Durch transienten Transfektionen in Schneider Drosophila Insektenzellen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von Sp1 und USp3 für die ADAM10-Promotoraktivität entscheidend ist. In EMSA-Studien bestätigte sich eine Protein-DNA-Interaktion für die Region -366 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Die Punktmutation in der CAAT-Box veränderte die die Promotoraktivität nicht. Da weiterhin für diese potentielle Bindungsstelle kein Bindungsfaktor vorausgesagt wurde, scheint die CAAT-Box keine Bedeutung bei der Promotorregulation zu spielen. Schließlich fand sich im EMSA eine Protein-DNA-Interaktion für die Bindungsstelle 203 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Diese in Computeranalysen als RXR-Bindungsstelle identifizierte Region ist ebenfalls von Bedeutung in der Promotorregulation. Auf der Suche nach Substanzen, die die ADAM10-Promotoraktivität beeinflussen, wurde ein negativer Effekt durch die apoptoseauslösende Substanz Camptothecin und ein positiver Effekt durch die zelldifferenzierungsauslösende Substanz all-trans Retinsäure festgestellt. Mit dieser Arbeit wurde die genomische Organisation des ADAM10-Gens zusammen mit dem zugehörigen Promotor aufgeklärt und ein neuer Regulationsmechanismus für die Hochregulation der Expression der alpha-Sekretase ADAM10 gefunden. Im Weiteren sollen nun die genauen Mechanismen bei der Hochregulation der alpha-Sekretase ADAM10 durch Retinsäure untersucht und durch Mikroarray-Analysen an RNA-Proben transgener Mäuse, welche ADAM10 überexpremieren, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer´schen Erkrankung identifiziert werden. The Adam10 gene encodes a disintegrin and metalloproteinase, which cleave the amyloid precursor protein (APP). In a mouse model it could be proven that overexpression of ADAM10 reduced the formation of A peptides, prevented their deposition in amyloid plaques and improved long-term potentiation. For a potential therapy of Alzheimer disease it is important to elucidate the organization of the human ADAM10 gene and its promoter. After comparison of the genomic sequences of human and mouse ADAM10 genes a high degree of conformity became evident. Both genes comprise 160 kbp and are composed of 16 exons. The first 500 bp upstream of the translation start sites are highly conserved between human, mouse and rat ADAM10 genes. This region contains specific regulatory elements, which modulate ADAM10 transcription. Within the first 2179 bp upstream of the human ADAM10 translation start site potential transcription factor binding sites (Brn-2, SREBP, Oct-1, Creb1/cJun, USF, Maz, Mzf-1, NFkB and CDPCR3HD) are located. A typic GC box and a CAAT box were identified, but a TATA box is absent. After cloning of the 2179 bp region a strong promoter activity was ascertained, particular in neural cell lines. By using deletion analysis the region between -508 and -300 was mapped to be essentially for activation of transcription. In addition, the promoter activity is strongly down regulated when a point mutation is introduced into the region 317 bp upstream of the translation start. By computer analysis this region was identified to contain an USF binding site which obviously plays a central role in ADAM10 transcription. By applying EMSA experiments a protein DNA interaction was demonstrated for this region. The critical involvement of Sp1 and USp3 transcription factors on ADAM10 promoter activation was proved in Drosophila insect cells by transient overexpression of these factors. In subsequent EMSA studies a protein DNA interaction for the region -366 bp upstream of the translation start site was determined. A point mutation in the CAAT box did not influence the promoter activity. Since for this putative binding site no binding factor was predicted, the CAAT box seems to be not relevant in ADAM10 promoter regulation. Finally in EMSA studies the region 203 bp upstream of the translation start site was identified to contain a protein DNA interaction. By computer analysis this region was identified to contain a RXR binding site which might be of importance in regulation of the promoter. The screening for compounds which affect ADAM10 promoter activity identified the apoptosis inducer camptothecin to be a negative modulator and retinoic acid as an activator of ADAM10 transcription. In the present work the genomic organization of the ADAM10 gene and its promoter was enlightened. Furthermore a mechanism for upregulation the expression of the alpha-secretase ADAM10 was identified. In further studies the mechanism of retinoic acid-induced upregulation of the alpha-secretase ADAM10 shall be investigated. Furthermore, by using microarray analysis differentially expressed genes shall be identified in ADAM10 transgenic mice. With both approaches new strategies for the treatment of Alzheimer disease may be discovered.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3775
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-7183
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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