Authors:	Friebe, Peter
Title:	RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation
Online publication date:	21-Mar-2005
Year of first publication:	2005
Language:	german
Abstract:	Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist. The Hepatitis C virus (HCV) is a member of the family Flaviviridae. HCV possesses a single-stranded RNA genome of positive polarity. This plus-strand RNA carries a single long open reading frame that encodes a polyprotein of ~3010 amino acids, which is cleaved into 10 different products. Translation of the HCV ORF is mediated via the 5' NTR that carries an internal ribosome entry site (IRES). Sequences in the 5' and 3' termini of plusstrand RNA viruses harbor cis acting elements important for efficient translation and replication. By using the HCV replicon system, we mapped and characterized the sequences in the 5' NTR required for RNA replication. By generating a series of replicons with HCV-poliovirus (PV) chimeric 5' NTRs we could show that (1) sequences upstream of the HCV IRES are essential for RNA replication, (2) the first 125 nucleotides of the HCV 5' NTR are sufficient for RNA replication, but such replicon molecules are severely impaired for multiplication, and (3) high level HCV replication requires sequences located within the IRES. These data provide the first identification of signals in the 5' NTR of HCV RNA essential for replication of this virus. The 3' NTR of HCV has a tripartite structure composed of an about 40-nucleotides-long variable region, a poly(U/UC) tract that has a heterogenous length and a highly conserved 98-nucleotides-long 3' terminal sequence designated X-tail or 3'X. In this study we found that a complete deletion of the variable region is viable but replication is reduced significantly. Only replicons in which the poly(U/UC) tract was replaced by a homouridine stretch of at least 26 nucleotides were able to replicate whereas RNAs with homopolymeric guanine, adenine, or cytosine sequences were inactive. Deletions of individual or all stem-loop structures in 3'X were not tolerated demonstrating that this region is most crucial for efficient RNA replication. Finally, we found that none of these deletions or substitutions within the 3' NTR affected RNA stability or translation demonstrating that the primary effect of the mutations was on RNA replication. In addition to RNA signals located in the NTRs, cis-acting replication elements (CREs) could also reside within the coding sequence. We identified a novel RNA element within the NS5B coding sequence indispensable for replication, designated as 5BSL3.2. Mutational disruption of 5BSL3.2 structure blocked RNA replication which could be restored when an intact copy of this RNA element was inserted into the 3’ NTR. By using this replicon design we mapped the elements in 5BSL3.2 critical for RNA replication. Most importantly, we discovered a nucleotide sequence complementarity between the upper loop of this RNA element and the loop region of stem-loop 2 in the 3’ NTR. These data provide strong evidence for a pseudoknot structure at the 3’ end of the HCV genome essential for replication.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3772
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-7109
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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