Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3760
Authors: Wenz, Christine
Title: Cell confluence as crucial regulator of ROS-induced toxicity: Analysis of t-BuOOH-induced cell death in vitro
Online publication date: 23-Sep-2019
Year of first publication: 2019
Language: english
Abstract: Oxidative stress due to excessive intracellular ROS formation can result in macromolecule damage and cell death. In vitro, ROS-induced apoptosis has been almost exclusively investigated in proliferating cells, although in vivo, cells establish cell-cell contacts and reside in the G1 cell cycle phase. Previous studies indicated that contact-inhibited compared to proliferating murine fibroblasts (NIH3T3) are resistant against t-BuOOH – a lipid ROS inducer, resembling oxidative stress in, e.g. neurodegenerative diseases and cancer. A role of cell-cell contacts in the resistance against ROS-induced cell death independent of a G1 arrest is so far not known. Resistance of early confluent versus semiconfluent NIH3T3 cells and human epithelial cells (HaCaT, Caco-2) against t-BuOOH-induced necrosis was proved via setup I+II independent of a G1 arrest. Vitality assays, flow cytometry, Western Blot analysis and laser scanning microscopy demonstrated that (i) confluent cells proliferated at the time point of t-BuOOH exposure, and (ii) semiconfluent cultures (serum-depleted; U0126-treated) that exhibited a similar amount of cells in G1 as confluent cultures, were comparably sensitive to t-BuOOH as semiconfluent, proliferating cultures. Increased detoxification of t-BuOOH due to a higher cell number in confluent cultures was excluded via setup II. Further analyses and comet assays revealed a similar (i) cytosolic ROS increase, (ii) basal GSH level, (iii) replication block, as well as (iv) DNA SSB formation / repair in confluent and semiconfluent NIH3T3 cells. Confluent cultures were in contrast protected against (i) NADH oxidation, (ii) a decrease in ATP, (iii) collapse of the MMP (∆ψm), and (iv) an increase in DNA DSBs in the presence of t-BuOOH. Further experiments identified (i) t-BuOOH as a novel inducer of lipid ROS-induced ferroptosis, (ii) a prosurvival role of p38, JNK and ATR, as well as (iii) Ca2+ as crucial mediator of ferroptosis and cellular damage. In summary, these findings present cell-cell contacts and Ca2+ as crucial regulators of t-BuOOH-induced ferroptosis in vitro and might help to develop therapies against ROS-induced diseases or multicellular resistance of solid tumors.
Oxidativer Stress durch eine übermäßige Bildung von intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) kann zur Schädigung von Makromolekülen und zum Zelltod führen. In vitro wurde die ROS-induzierte Apoptose fast ausschließlich in proliferierenden Zellen untersucht, obwohl Zellen in vivo Zell-Zell-Kontakte ausbilden und in der G1-Zellzyklusphase verbleiben. Bisherige Studien zeigten, dass kontaktinhibierte verglichen mit proliferierenden Mausfibroblasten (NIH3T3) resistent sind gegenüber t-BuOOH – einem Agens, das Lipid ROS ähnlich oxidativem Stress z.B. bei neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs auslöst.Eine Rolle von Zell-Zell-Kontakten bei der Resistenz gegenüber dem ROS-induzierten Zelltod unabhängig von einem G1-Arrest ist bislang nicht bekannt. Die Resistenz früh konfluenter versus semikonfluenter NIH3T3- und humaner Epithel-Zellen (HaCaT, Caco-2) gegenüber der t-BuOOH-induzierten Nekrose wurde unabhängig von einem G1-Arrest mithilfe Setup I+II nachgewiesen. Vitalitäts-analysen, Durchflusszytometrie, Western Bot Analysen und Laserscanmikroskopie zeigten, dass (i) konfluente Zellen zum Zeitpunkt der t-BuOOH-Exposition proliferierten und (ii) semikonfluente Kulturen (serum-depletiert oder U0126-behandelt), welche eine zu konfluenten Kulturen ähnliche Menge an Zellen in G1 aufwiesen, genauso sensitiv gegenüber t-BuOOH waren wie semikonfluente, proliferierende Kulturen. Eine verstärkte Entgiftung von t-BuOOH durch eine höhere Zellzahl in konfluenten Kulturen wurde ausgeschlossen mittels Setup II. Weitere Analysen und Comet assays zeigten einen ähnlichen (i) zytosolischen ROS-Anstieg, (ii) basalen GSH-Level, (iii) Replikationsblock und (iv) Bildung / Reparatur von DNA-Einzelstrangbrüchen in konfluenten und semikonfluenten NIH3T3-Zellen. Konfluente Zellen waren dahingegen geschützt vor (i) NADH-Oxidation, (ii) ATP-Abnahme, (iii) MMP (∆ψm)-Kollaps, und (iv) dem Anstieg von DNA-Doppelstrangbrüchen durch t-BuOOH. Weitere Experimente identifizierten (i) t-BuOOH als Induktor der Lipid ROS-induzierten Ferroptose, (ii) eine „prosurvival“ Rolle von p38, JNK und ATR, als auch (iii) Ca2+ als zentralen Vermittler der Ferroptose und der zellulären Schäden. Zusammenfassend präsentieren diese Ergebnisse Zell-Zell-Kontakte und Ca2+ als zentrale Regulatoren der t-BuOOH-induzierten Ferroptose in vitro und mögen hilfreich sein, um Therapien gegen ROS-induzierte Erkrankungen und die multizelluläre Resistenz von soliden Tumoren zu entwickeln.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3760
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000030920
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: IX, 216 Blätter
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