Authors:	Han, Dandan
Title:	Analysis of Neil DNA glycosylases during early Xenopus development
Online publication date:	17-Sep-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	DNA demethylation plays an important role in development and vertebrate physiology. In active DNA demethylation, 5-methylcytosine (5mC) is iteratively oxidized into 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-caboxylcytosine (5caC) by Ten-eleven-translocation (TET) enzymes. Subsequently, 5fC and 5caC are removed by Thymine DNA glycosylase (TDG) and base excision repair (BER) proteins. In vitro data indicate that Nei-like (NEIL) glycosylases play a crucial role in this context by increasing the enzymatic turnover of TDG in BER. In the first part of my thesis, I analyzed the role of Tet3, Tdg, and especially Neil proteins in active DNA demethylation in Xenopus laevis embryos. Expression analysis showed that tet3, tdg, neil1 and neil3 are expressed during the embryonic development of the central nervous system. Neil2 mRNA is maternally supplied, and its expression level is decreased drastically upon zygotic genome activation (ZGA). Analysis of 5mC and its oxidative derivatives by mass spectrometry supports the cooperation of Tet3, Tdg, and Neil2 in active DNA demethylation in vivo. Antisense Morpholino (MO) knockdown of Tet3, Tdg, Neil2 and Neil3 induces neural crest defects and microcephaly. In the second part of my thesis, I examined the mechanisms leading to the neural crest cell (NCC) defects and microcephaly phenotypes of neil2 MO injected embryos (Neil2 morphants). Whole transcriptome analysis and qPCR expression analysis show that the Tp53 DNA damage pathway is activated in Neil2 morphants. In Neil2 morphant neural plates, pS345 Chk1, Tp53, and active caspase-3 accumulate during NCC differentiation. Knockdown of Tp53 reduces apoptotic cell death and rescues microcephaly in Neil2 morphants. Neural crest defects and microcephaly are recapitulated by treating embryos with the reactive oxygen species (ROS) inducer pyocyanin. This treatment upregulates protein levels of pS345 Chk1, Tp53, and active caspase-3, and activates expression of Tp53 target genes. Pyocyanin and neil2 MO injection show synergistic effects in inducing microcephaly. Furthermore, Neil2 morphants display craniofacial abnormalities, mimicking Treacher-Collins-Syndrome. In summary, my study demonstrates a novel role of Neil2 in cooperation with Tet3 and Tdg in active DNA demethylation during Xenopus embryogenesis. In addition, Neil2 deficiency elicits an oxidative stress-induced, Tp53-dependent DNA damage response, which impairs NCC differentiation. My work emphasizes how defects in BER can lead to a selective lineage defect during embryogenesis. DNA-Demethylierung spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Physiologie von Vertebraten. Während der aktiven DNA-Demethylierung wird 5-Methylcytosin (5mC) von Ten-eleven-translocation (TET) Enzymen iterativ zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC), sowie 5-Carboxylcytosin (5caC) oxidiert. 5fC und 5caC werden daraufhin von Thymine DNA Glycosylase (TDG) und Enzymen der Basenexzisionsreparatur (BER) aus der DNA entfernt. In vitro Daten belegen, dass Nei-like (NEIL) Glykosylasen eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielen, indem sie den enzymatischen Durchsatz von TDG erhöhen. In dieser Arbeit habe ich die Rolle von Tet3, Tdg und insbesondere der Neil Glykosylasen während der aktiven DNA-Demethylierung in Xenopus laevis Embryonen analysiert. Tet3, tdg, neil1 und neil3 werden während der embryonalen Entwicklung des zentralen Nervensystems exprimiert. Neil2 mRNA wird maternal bereitgestellt und verringert sich drastisch nach der zygotischen Genomaktivierung (ZGA). Eine massenspektrometrische Analyse von 5mC und seinen oxidativen Derivaten bestätigt die Kooperation von Tet3, Tdg und Neil2 während der aktiven DNA-Demethylierung in vivo. Ein Antisense-Morpholino vermittelter Knockdown von Tet3, Tdg, Neil2 und Neil3 führt zu Defekten in der Neuralleistenentwicklung und Mikrozephalie. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die Mechanismen, die zu den erwähnten Phänotypen der neil2-Morpholino injizierten Embryonen führen. Transkriptom, sowie qPCR-Analysen zeigen eine Aktivierung der Tp53-abhängigen DNA-Schadens-Antwort in neil2-Morpholino injizierten Embryonen. In den Neuralplatten dieser Embryonen ist pS345 Chk1, Tp53 und aktive Caspase-3 erhöht. Ein Knockdown von Tp53 vermindert Apoptose und den Mikrozephalie-Phänotyp der neil2-Morpholino injizierten Embryonen. Neuralleistendefekte und Mikrozephalie werden in Wildtyp-Embryonen durch Zugabe von Pyocyanin, einem Produzenten von reaktiven Sauerstoffspezies, imitiert, einhergehend mit erhöhter Proteinmenge von Tp53 und Expression von Tp53-Zielgenen. Pyocyanin und neil2-Morpholinoinjektion erzielen einen synergistischen Effekt bei der Induzierung von Mikrozephalie. Des Weiteren weisen neil2-Morpholino injizierte Embryonen kraniofaziale Fehlbildungen auf, die dem Treacher-Collins-Syndrom ähneln. Zusammenfassend demonstriert meine Arbeit eine bisher unbekannte Rolle von Neil2, in Kooperation mit Tet3 und Tdg bei der aktiven DNA-Demethylierung während der Xenopus-Embryogenese. Zudem induziert der Verlust von Neil2 eine durch oxidativen Stress verursachte, Tp53-abhängige DNA-Schadens-Antwort, welche die Neuralleisten-differenzierung beeinträchtigt. Meine Arbeit verdeutlicht, wie BER-Defekte zu selektiven Differenzierungsdefekten während der Embryogenese führen können
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3757
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000030882
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	132 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen