Authors:	Herrmann, Ann-Kathrin
Title:	Dimethyl fumarate alters intracellular calcium handling by redox-mediated pleiotropic effects
Online publication date:	2-Aug-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Dimethyl fumarate (DMF) is a treatment option for the autoimmune diseases multiple sclerosis and psoriasis. It causes short-term oxidative stress and induces the antioxidant response via the transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Its immunosuppressive effect, however, is poorly understood. As calcium signaling plays a crucial role in the correct functioning of the immune system, this work focuses on understanding how DMF influences the calcium homeostasis in immune cells and if the DMF-induced changes in cellular redox state are responsible for such changes. I confirmed that DMF evoked short-term oxidative stress in immune cells, which was resolved after 24 h through increased glutathione levels. The major finding of this work was an increase of cytosolic calcium levels in splenocytes immediately after DMF application that remained elevated as a long-term effect. The assumption that the immediate increase of cytosolic calcium was caused by calcium influx through the transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) channel could not entirely be confirmed. I detected a DMF-caused reduced calcium store content, which could be explained by a reduced expression of the calcium store refilling sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2b (SERCA2b). However, SERCA activity was increased due to S-glutathionylation of the redox-regulated cysteine 674. A reduced stromal interaction molecule 1 (STIM1) abundance fits the results that store-operated calcium entry (SOCE) was significantly reduced after DMF treatment. Additionally, oligomerization of STIM1 was found to be modified by reduced glutathione, a hallmark of oxidative stress. STIM1 mutants of the highly conserved cysteines 49 and 56 showed less punctae formation compared to STIM1 wildtype cells when triggered with store depletion. Surprisingly, in contrast to published literature, SOCE was increased in all STIM1 mutants and I did not find any increase in oxidative-stress induced calcium entry. No signs of endoplasmic reticulum (ER) stress were detected, nor changes in glucose uptake, but mitochondrial respiration was altered. The expression of the transcription factors nuclear factor of activated T cells (NFAT) and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) was not altered, but NFAT translocation was increased. In summary, DMF causes pleiotropic changes at different levels of the cellular calcium homeostasis, probably due to its ability to redox-modify protein thiols. Dimethylfumarat (DMF) ist eine Behandlungsoption für die Autoimmunkrankheiten Multiple Sklerose und Psoriasis. Es verursacht kurzfristigen oxidativen Stress und induziert die anti-oxidative Antwort über den Transkriptionsfaktor Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 (Nrf2). Der Mechanismus seiner immunsuppressiven Wirkung ist jedoch kaum bekannt. Da Kalziumsignalwege eine sehr wichtige Rolle für das korrekte Funktionieren des Immunsystems spielen, konzentrierte sich diese Arbeit darauf, zu verstehen, wie DMF die Kalziumhomöostase in Immunzellen beeinflusst und ob die durch DMF induzierten Veränderungen des zellulären Redoxzustandes dafür verantwortlich sind. Ich konnte bestätigen, dass der durch DMF verursachte kurzzeitige oxidative Stress in Immunzellen nach 24 h durch einen erhöhten Glutathionspiegel kompensiert wird. Die wichtigste Beobachtung dieser Arbeit war, dass zytosolische Kalziumlevel in Splenozyten sofort nach DMF-Gabe und auch als Langzeiteffekt erhöht sind. Ein vermehrter Kalziumeinstrom durch den Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1)-Kanal als Ursache für den sofortigen Kalziumanstieg konnte nicht eindeutig bewiesen werden. DMF reduzierte die Kalziumspiegel der intrazellulären Kalziumspeicher, was durch eine geringere Proteinexpression der Sarco/endoplasmatischen Retikulum Ca2+-ATPase 2b (SERCA2b) erklärbar wäre. Die SERCA2b-Aktivität war jedoch aufgrund vermehrter S-Glutathionylierung des redoxregulierten Cysteins 674 erhöht. Der Store-Operated Calcium Entry (SOCE), der Kalziumeinstrom in die Zelle, war nach DMF-Behandlung ebenso signifikant reduziert wie die Expression von Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1). STIM1-Mutanten der hochkonservierten Cysteine 49 und 56 zeigten im Vergleich zu STIM1-Wildtyp-Zellen eine geringere Punctaebildung, wenn sie durch Speicherentleerung getriggert wurden. Im Gegensatz zu veröffentlichter Literatur war der SOCE überraschenderweise bei allen STIM1-Mutanten erhöht. Es konnten weder Anzeichen von Stress im Endoplasmatischen Retikulum (ER) noch Veränderungen der Glukoseaufnahme festgestellt werden, aber die mitochondriale Respiration der Zellen war modifiziert. Die Expression der Transkriptionsfaktoren Nuclear Factor of Activated T cells (NFAT) und Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B cells (NF-κB) war nicht verändert, aber die NFAT-Translokation erhöht. Zusammengefasst verursacht DMF pleiotrope Veränderungen in verschiedenen Level der zellulären Kalziumhomöostase wahrscheinlich aufgrund seiner Fähigkeit, Proteinthiole redoxmodifizieren zu können.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3729
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000030202
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VII, 130 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen