Authors:	Sauer, Caroline
Title:	Einfluss subviraler Partikel des humanen Cytomegalovirus auf die Induktion der antiviralen Immunantwort
Online publication date:	29-Jan-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der insbesondere bei Patienten mit unreifem oder geschwächtem Immunsystem schwere, teilweise lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird die Entwicklung einer Impfung gegen HCMV mit großem Nachdruck verfolgt. Subvirale Partikel des HCMV, sogenannte Dense Bodies (DB), stellen eine vielversprechende Impfstoff-Grundlage dar. Die innere Struktur der Partikel besteht aus viralen Proteinen, die als dominante Antigene der zellulären Immunantwort gegen HCMV identifiziert wurden. Die äußere Hülle der Partikel entspricht der Virushülle, sie enthält die viralen Oberflächenproteine als Zielantigene der neutralisierenden Antikörper (NTAk)-Antwort in ihrer natürlichen Konformation. Die für ein Totantigen außergewöhnlich hohe Immunogenität der Partikel wurde bereits in Vorarbeiten dokumentiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Hintergrund für die herausragenden, immunogenen Eigenschaften von DB aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die Hypothese geprüft, dass DB geeignet sind, die Ausreifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) zu vermitteln und damit deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation zu stimulieren. Derart aktivierten DC kommt eine wichtige Rolle beim Priming der T-lymphozytären Immunantwort zu. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von unreifen dendritischen Zellen (iDC) mit DB zu verstärkter Expression von solchen Molekülen auf der DC-Oberfläche führt, die mit Ausreifung der Zellen verknüpft sind. Der Nachweis der verstärkten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine belegte die Aktivierung der Zellen im Sinne einer entzündlichen Reaktion. Die erfolgreiche Stimulation von CD4 und CD8 T-Lymphozyten durch DB-behandelte DC belegte schließlich die funktionelle Relevanz der Ergebnisse. Zusammengefasst konnten in diesem Abschnitt der Arbeit die molekularen Grundlagen der adjuvanten Wirkung von DB aufgeklärt werden. rnIn einem zweiten Abschnitt wurde die NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung näher untersucht. Der humoralen Immunantwort kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Prävention der HCMV-Übertragung zu. Hier galt es zu prüfen, welchen Einfluss stammspezifische Unterschiede in der Expression viraler Oberflächenproteine auf die Induktion der NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung nehmen. Im Fokus stand dabei die variable Expression des pentameren Proteinkomplexes aus den viralen Proteinen gH/gL/pUL128-UL131A. Dieser Komplex wird nur von kliniknahen HCMV-Stämmen (HCMVKlin) exprimiert und ist für deren breiten Zelltropismus verantwortlich. Der pentamere Komplex fehlte in allen bisherigen Analysen der DB-Immunogenität, die auf der Grundlage von Laborstämmen des HCMV (HCMVLab) durchgeführt worden waren. Ein erster Versuchsansatz zeigte, dass die NTAk-Antwort, die durch DB von HCMVLab (DBLab) induziert wird, auch gegen die Infektion mit HCMVKlin einen gewissen Schutz vermittelt. Dies war ein überraschender Befund, da Antikörpern gegen den pentameren Komplex eine entscheidende Rolle bei der Neutralisation von HCMVKlin zugeschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass Antikörper gegen andere Zielstrukturen zur Neutralisation von HCMVKlin beitragen. Hieraus resultierte unmittelbar die Frage, inwieweit eine Aufnahme des pentameren Komplexes in einen DB-basierten Impfstoff überhaupt notwendig war. Um dies zu beantworten war es notwendig, DB herzustellen, die den pentameren Komplex enthielten. Hierzu wurde ein HCMVLab durch Mutagenese des 235 kpb Genoms so modifiziert, dass von dem resultierenden Stamm der pentamere Komplex exprimiert wurde. In gereinigten DB dieses Stammes konnten die Komponenten des pentameren Komplexes nachgewiesen werden. Die Seren von Tieren, die mit DB dieses neuen Stammes immunisiert wurden, zeigten in der Tat eine deutlich gesteigerte Kapazität zur Neutralisation von HCMVKlin auf verschiedenen Zielzellen. Diese Ergebnisse unterstreichen schlussendlich, dass die Expression des pentameren Komplexes einen Vorteil bei der Induktion der antiviralen NTAk-Antwort erbringt. Zusammengefasst liefern die Erkenntnisse aus dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der immunogenen Wirkung von DB. Auf dieser Grundlage war es nunmehr möglich, ein Projekt zur Austestung der DB-Vakzine in einer ersten klinischen Studie zu initiieren. The human cytomegalovirus (HCMV) is an opportunistic agent that may cause serious and life-threating diseases in individuals with a premature or a compromised immune system. Because of its clinical relevance, the development of a vaccine is a major goal in biomedical science. Subviral dense bodies (DB) represent a promising basis for the HCMV vaccine development. The internal structure of these particles consists of dominant target antigens of the T lymphocyte responses. The envelope of DB resembles that of mature virions and contains the viral surface proteins, the targets of the neutralizing antibody (ntabs) response, in their natural conformation. The extraordinary immunogenicity of DB had been documented before. One goal of this work was to elucidate the molecular background of the extraordinary immunogenicity of DB. In a first part, the hypothesis was tested that DB mediate maturation and activation of dendritic cells (DC), thereby enhancing their capacity for antigen presentation. Such cells play an important role in the priming of T-lymphocyte responses. DB loading of DC resulted in up-regulation of co-stimulatory molecules that are related to the maturation of these cells. The release of pro-inflammatory cytokines provided the evidence for DC activation, representing an inflammatory response. DB loaded DC were further suitable to stimulate CD4 and CD8 T cell responses. These results showed that DB indeed impart an adjuvant effect which is the basis for their immunogenic properties. rnThe ntabs response to DB immunization was analyzed in a second part of this work. Antibodies are key effectors for the prevention of HCMV transmission. One task of this work was to test, if strain specific differences in the expression of viral surface proteins had an impact on the induction of ntabs following DB immunization. The major parameter to be tested here was whether the variable expression of a pentameric protein complex, consisting of gH/gL/pUL128-UL131A influenced the ntabs response. This complex is an integral part of the surface of clinical HCMV isolates (HCMVClin), only, and determines their broad host cell range; laboratory strains (HCMVLab) are devoid of this complex and thus the response towards it had not been addressed in past studies on DB immunogenicity, based on DBLab. A first set of experiments showed that DBLab immunization induced an ntabs response that are also, to some extent, protective against HCMVClin infection. This was a surprising finding, as, according to current literature, one would have expected antibodies specific for the pentameric complex to be essential for HCMVClin neutralization. In contrast to that, this work showed that the response to other surface protein complexes may suffice to confer some level of protection. This raised the question about the requirement to include the pentameric complex in a DB-based vaccine. In order to investigate, if DB containing the pentameric complex were more effective in inducing ntabs, a laboratory strain was modified by mutating its 235 kpb genome in a way to allow expression of the pentameric complex. The components of the pentameric complex could be detected in DB of this strain, providing the proof that DB do also package the pentameric complex. The sera of animals that were immunized with these DB indeed showed increased neutralization capacity on different cell types. These results underscore that the expression of the pentameric complex on DB confers an advantage over DBLab in inducing ntabs. Taken together the findings of this work provide a valuable contribution in our understanding of the immunogenicity of DB. This work has provided the basis for a now ongoing project to test the DB-vaccine in first clinical trials.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3682
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-36463
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	122 S.
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