Authors:	Kaiser, Steffen
Title:	Investigations on DNA methylation by Dnmt2 and impact of tRNA modifications on TLR7 stimulation
Online publication date:	18-Dec-2015
Year of first publication:	2015
Language:	english
Abstract:	The incorporation of modified nucleotides into ribonucleic acids (RNAs) is important for their structure and proper function. These modifications are inserted by distinct catalytic macromolecules one of them being Dnmt2. It methylates the Cytidine (C) at position 38 in tRNA to 5-methylcytidine (m5C). Dnmt2 has been a paradigm in this respect, because all of its nearest neighbors in evolution are DNA-cytosine C5-methyltransferases and methylate DNA, while its (own) DNA methyltransferase activity is the subject of controversial reports with rates varying between zero and very weak. This work determines whether the biochemical potential for DNA methylation is present in the enzyme. It was discovered that DNA fragments, when presented as covalent RNA:DNA hybrids in the structural context of a tRNA, can be more efficiently methylated than the corresponding natural tRNA substrate. Additional minor deviations from a native tRNA structure that were seen to be tolerated by Dnmt2 were used for a stepwise development of a composite system of guide RNAs that enable the enzyme to perform cytidine methylation on single stranded DNA in vitro. Furthermore, a proof-of-principle is presented for utilizing the S-adenosyl methionine-analog cofactor SeAdoYn with Dnmt2 to search for new possible substrates in a SELEX-like approach.rnIn innate immunity, nucleic acids can function as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) recognized by pattern recognition receptors (PRRs). The modification pattern of RNA is the discriminating factor for toll-like receptor 7 (TLR7) to distinguish between self and non-self RNA of invading pathogens. It was found that a 2'-O-methylated guanosine (Gm) at position18, naturally occurring at this position in some tRNAs, antagonizes recognition by TLR7. In the second part of this work it is pointed out, that recognition extends to the next downstream nucleotide and the effectively recognized molecular detail is actually a methylated dinucleotide. The immune silencing effect of the ribose methylation is most pronounced if the dinucleotide motif is composed of purin nucleobases whereas pyrimidines diminish the effect. Similar results were obtained when the Gm modification was transposed into other tRNA domains. Point mutations abolishing base pairings important for a proper tertiary structure had no effect on the immune stimulatory potential of a Gm modified tRNA. Taken together these results suggest a processive type of RNA inspection by TLR7.rn Der Einbau modifizierter Nukleotide in Ribonukleinsäuren (RNAs) ist wichtig für deren richtige Struktur und Funktion. Diese Modifikationen werden von bestimmten katalytisch aktiven Makromolekülen eingebaut. Ein solches Enzym ist Dnmt2. Von ihm wird das Cytidin (C) an Position 38 in tRNA zu 5-Methylcytidin (m5C) methyliert. Dnmt2 war diesbezüglich eine Besonderheit, da alle näheren evolutionären Verwandten DNA-Cytosin C5-Methyltransferasen sind und dementsprechend DNA methylieren. Die DNA-Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 ist dagegen Thema kontroverser Berichte und schwankt zwischen sehr gering und nicht vorhanden. In dieser Arbeit wird untersucht, ob Dnmt2 biochemisch dazu in der Lage ist DNA zu methylieren. Die Ergebnisse zeigen, dass DNA, wenn sie kovalent in RNA:DNA Hybriden im strukturellen Kontext einer tRNA vorliegt, von Dnmt2 methyliert werden kann. Außerdem wurden weitere kleinere Abweichungen von einer nativen tRNA entdeckt, die von Dnmt2 toleriert werden und dazu genutzt um Schritt für Schritt ein System zu entwickeln, um mit Hilfe von Guide RNAs ein eigenständiges DNA Molekül mit Dnmt2 in vitro zu methylieren. Desweiteren wird gezeigt, wie der S-Adenosylmethionin analoge Cofaktor SeAdoYn benutzt werden könnte um in einem SELEX-artigen Ansatz neue Dnmt2 Substrate zu entdecken.rnIm angeborenen Immunsystem können Nukleinsäuren als pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) fungieren, die von so genannten Pattern Recognition Rezeptoren (PRRs) erkannt werden. TLR7 nutzt das Modifizierungsmuster einer RNA um zwischen körpereigenen RNAs und den RNAs von pathogenen Organismen zu unterscheiden. Ein 2‘-O-methyliertes Guanosin (Gm), das in einigen tRNAs an Position 18 vorkommt, sorgt dafür, dass die tRNA zu einem TLR7 Antagonisten wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass das auf das 2‘-O-methylierte folgende Nukleotid auch für die Erkennung wichtig ist und das von TLR7 erkannte molekulare Detail in Wirklichkeit ein methyliertes Dinukleotid ist. Der immununterdrückende Effekt ist am stärksten ausgeprägt, wenn das Dinukleotid Motiv aus Purin Basen besteht, während für Pyrimidine der Effekt abgeschwächt bis gar nicht vorhanden ist. Die Ergebnisse behalten auch ihre Gültigkeit, wenn die Modifikation in andere tRNA Domänen transplantiert wird. Punktmutationen, die die Ausbildung der Tertiärstruktur unterbinden, hatten keinen Einfluss auf die Stärke der Immunstimulation. Die Ergebnisse sprechen daher für eine abtastende RNA Untersuchung durch TLR7.rn
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3641
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-42420
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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