Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3631
Authors: Schulze, Martin
Title: Genexpressionsanalyse boviner mesenchymaler Stammzellen und deren in-vitro-differenzierten Folgelinien
Online publication date: 15-Dec-2015
Language: german
Abstract: Mesenchymale Stamzellen (MSC) sind Vertreter der adulten Stammzellen. Sie bergen durch ihre große Plastizität ein immenses Potential für die klinische Nutzung in Form von Stammzelltherapien. Zellen dieses Typs kommen vornehmlich im Knochenmark der großen Röhrenknochen vor und können zu Knochen, Knorpel und Fettzellen differenzieren. MSC leisten einen wichtigen Beitrag im Rahmen regenerativer Prozesse, beispielsweise zur Heilung von Frakturen. Breite Studien demonstrieren bereits jetzt auch bei komplexeren Erkrankungen (z.B. Osteoporose) therapeutisch vielversprechende Einsatzmöglichkeiten. Oft kommen hierbei aus MSC gezielt differenzierte Folgelinien aus Zellkulturen zum Einsatz. Dies bedingt eine kontrollierte Steuerung der Differenzierungsprozesse in vitro. Der Differenzierung einer Stammzelle liegt eine komplexe Veränderung ihrer Genexpression zugrunde. Genexpressionsmuster zur Erhaltung und Proliferation der Stammzellen müssen durch solche, die der linienspezifischen Differenzierung dienen, ersetzt werden. Die mit der Differenzierung einhergehende, transkriptomische Neuausrichtung ist für das Verständnis der Prozesse grundlegend und wurde bislang nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine transkriptomweite und vergleichende Genexpressionsanalyse Mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien mittels Plasmid - DNA Microarrays und Sequenziertechniken der nächsten Generation (RNA-Seq, Illumina Plattform). In dieser Arbeit diente das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus, da es genetisch betrachtet eine hohe Ähnlichkeit zum Menschen aufweist und Knochenmark als Quelle von MSC gut verfügbar ist. Primärkulturen Mesenchymaler Stammzellen konnten aus dem Knochenmark von Rindern erfolgreich isoliert werden. Es wurden in vitro Zellkultur - Versuche durchgeführt, um die Zellen zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Zur Genexpressionsanalyse wurde RNA aus jungen MSC und einer MSC Langzeitkultur („alte MSC“), sowie aus den differenzierten Zelllinien isoliert und für nachfolgende Experimente wo nötig amplifiziert. Der Erfolg der Differenzierungen konnte anhand der Genexpression von spezifischen Markergenen und mittels histologischer Färbungen belegt werden. Hierbei zeigte sich die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten erfolgreich, während die Differenzierung zu Chondrozyten trotz diverser Modifikationen am Protokoll nicht erfolgreich durchgeführt werden konnte. Eine vergleichende Hybridisierung zur Bestimmung differentieller Genexpression (MSC vs. Differenzierung) mittels selbst hergestellter Plasmid - DNA Microarrays ergab für die Osteogenese mit Genen wie destrin und enpp1, für die undifferenzierten MSC mit dem Gen sema3c neue Kandidatengene, deren biologische Funktion aufzuklären in zukünftigen Experimenten vielversprechende Ergebnisse liefern sollte. Die Analyse der transkriptomweiten Genexpression mittels NGS lieferte einen noch umfangreicheren Einblick ins Differenzierungsgeschehen. Es zeigte sich eine hohe Ähnlichkeit im Expressionsprofil von jungen MSC und Adipozyten, sowie zwischen den Profilen der alten MSC (eine Langzeitkultur) und Osteoblasten. Die alten MSC wiesen deutliche Anzeichen für eine spontane Differenzierung in die osteogene Richtung auf. Durch Analyse der 100 am stärksten exprimierten Gene jeder Zelllinie ließen sich für junge MSC und Adipozyten besonders Gene der extrazellulären Matrix (z.B col1a1,6 ; fn1 uvm.) auffinden. Sowohl Osteoblasten, als auch die alten MSC exprimieren hingegen verstärkt Gene mit Bezug zur oxidativen Phosphorylierung, sowie ribosomale Proteine. Eine Betrachtung der differentiellen Genexpression (junge MSC vs. Differenzierung) mit anschließender Pathway Analyse und Genontologie Anreicherungsstatistik unterstützt diese Ergebnisse vor allem bei Osteoblasten, wo nun jedoch zusätzlich auch Gene zur Regulation der Knochenentwicklung und Mineralisierung in den Vordergrund treten. Für Adipozyten konnte mit Genen des „Jak-STAT signaling pathway“, der Fokalen Adhäsion, sowie Genen des „Cytokine-cytokine receptor interaction pathway“ sehr spannende Einsichten in die Biologie dieses Zelltyps erlangt werden, die sicher weiterer Untersuchungen bedürfen. In undifferenzierten MSC konnte durch differentielle Genexpressionsanalyse die Rolle des nicht kanonischen Teils des WNT Signalweges als für die Aufrechterhaltung des Stammzellstatus potentiell äußerst einflussreich ermittelt werden. Die hier diskutierten Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass besonders mittels Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatzverfahren wertvolle Einblicke in die komplexe Biologie der Stammzelldifferenzierung möglich sind. Als Grundlage für nachfolgende Arbeiten konnten interessante Gene ermittelt und Hypothesen zu deren Einfluss auf Stammzelleigenschaften und Differenzierungsprozesse aufgestellt werden. Um einen besseren Einblick in den Differenzierungsverlauf zu ermöglichen, könnten künftig NGS Analysen zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten durchgeführt werden. Zudem wären weitere Anstrengungen zur erfolgreichen Etablierung der chondrogenen Differenzierung zur vollständigen Analyse der Genexpression des trilinearen Differenzierungspotentials von MSC wünschenswert.
Bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells (MSC) present an interesting target for future stem cell therapies due to their high degree of plasticity. MSC can be differentiated into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts and hence play an important role in tissue development and regeneration. Different studies demonstrated a potential medical use in post traumata tissue repair or in the treatment of even more complex diseases like osteoporosis. For potential therapeutically usage, the stem cell itself as well as their in vitro differentiated successor lines may be applied. Stem cell differentiation is a key factor in stem cell biology and yet not fully understood. The differentiation process is mediated through a complex and highly controlled alteration of gene expression patterns. The expression of genes necessary to keep MSC in stem cell state has to be substituted by the expression of genes governing lineage specific differentiation. The present study aims to comprehensively investigate the gene expression profile of undifferentiated MSC and their in vitro differentiated successor lines by the use of high throughput methods like DNA – Microarrays and Illumina based RNA-seq. In this thesis, the cow (Bos taurus) was used as a model organism. Cows and humans share a similar cell biology and also proved be comparable in concerns of the amount and the identity of protein coding genes. Moreover, bovine bone marrow as a source of MSC, is broadly available. A cell culture of primary bovine MSC could be successfully isolated from bone marrow aspirates of freshly slaughtered cows. After prolonging the cells in vitro, they were transformed into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes by growing them in distinct media driving the desired differentiation process. RNA was isolated from undifferentiated and differentiated cell lines and in vitro amplified where necessary to support material intensive downstream applications to determine the underlying gene expression pattern. The success of in vitro differentiation was monitored by cell line specific histological staining and marker gene expression analysis. It could be shown that MSC were successfully differentiated into adipocytes and osteoblasts, while the differentiation into chondrocytes unfortunately failed although different protocols and media types have been applied trying to overcome this problem. Comparative gene expression analysis (MSC versus differentiated cell lines) based on medium throughput in house manufactured plasmid DNA-Microarrays (~900 genes) identified interesting candidates (destrin, enpp1) with a yet unknown function in osteogenesis. Additionally, microarray experiments suggest the gene sema3c to possibly play a role in maintaining stem cell state of MSC. Comparison of transcriptome wide gene expression profiles using Illumina RNA-Seq data allowed an even more comprehensive view on the alteration of gene expression during cell differentiation. It could be shown that undifferentiated MSC and adipocytes share a more similar gene expression pattern, while long term cultured MSC spontaneously differentiated into osteoblast like cells. To determine the biological meaning behind changes in gene expression patterns of differentiated cells compared to MSC, the 100 strongest expressed genes of each cell line were annotated to their corresponding gene ontology terms. MSC and Adipocytes strongly express genes associated with the extracellular matrix formation (col1a1, col1a6, fn1 and others). In contrast, osteoblasts and long term cultured MSC show a high expression of genes associated with oxidative phosphorylation and protein biosynthesis (eg. ribosomal proteins). In a second approach to get further insights into each cell lines unique gene expression profile, differentially expressed genes (MSC versus differentiated cells) were determined using RNA-seq data and candidate gene lists were subsequently mapped against biological pathways. It could be shown that osteoblasts uniquely express genes associated with the regulation of bone development and biomineralization. Adipocytes differentially express genes part of the Jak-STAT-signaling pathway and those associated with focal adhesion or cytokine-cytokine receptor interaction. In MSC, genes associated to the non-canonical part of the WNT signaling pathway seems to play an important role in maintaining the stem cell state. High throughput gene expression profiling based on Microarrays and RNA-Seq data proved to be powerful tool to systematically analyze and compare complex biological processes. Taken together, the results of this thesis present a solid groundwork allowing targeted future experiments towards better understanding stem cell biology and stem cell differentiation.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3631
URN: urn:nbn:de:hebis:77-42289
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
4228.pdf12.94 MBAdobe PDFView/Open