Authors:	Roemer, Niels van de
Title:	Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie
Online publication date:	15-Dec-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn Non-synonymous tumor-specific mutations are an attractive target pool for cancer immunotherapy as they lack expression in healthy tissues and can potentially be recognized as neo-antigens by the mature T-cell repertoire. In principle, any genetic alteration has the potential to generate mutated peptides that are presented by either surface MHC class-I or -II molecules and may represent an ideal target for neo-epitope tumor vaccination. As human cancers are expected to carry thousands of non-synonymous mutations on average which are not subject to central immune tolerance, these mutations may represent optimal candidates for vaccine development. To characterize the immunogenicity of such mutations in a given tumor, a streamlined approach for the prediction and validation of neo-epitopes derived from B16-F10 murine melanoma was implemented. More than 500 non-synonymous point mutations were identified by whole exome sequencing. After selection of expressed genes and good potential MHC binders of the respective mutated epitopes, 50 mutations were chosen and validated by Sanger sequencing. rnIntending to define the immunogenicity of mutation-coding sequences, 27-mer peptides (comprising all potential MHC class I and II epitopes of 8 to 14 amino acids in length) were designed that encoded either the mutated or the wild-type amino acid to immunize C57BL/6 mice. Anti-tumor potency of all immunogenic epitopes was investigated in a transplantable B16-F10 melanoma model where mice immunized with mutation-encoding mRNA (RNA) revealed tumor control in the protective as well as the therapeutic setting for a substantial number of mutated epitopes. rnSurprisingly, one MHC class II-restricted epitope (Mut-30) was identified that conferred tumor control beyond the efficacy of known immunodominant tumor-associated antigens like Trp2 or gp100. To further examine the mechanism of the anti-tumoral potency of this mutated epitope, the active role of CD4+, CD8+ and NK T cells was investigated during early and late stages of tumor development and therapy. Depletion studies demonstrated that CD4+ but not CD8+ T cells are crucial for the observed anti-tumoral activity of Mut-30 RNA vaccination. Mutation-specific, IFN--expressing CD4+ T cells were shown to be increased in the tumor tissue in response to Mut-30 RNA vaccination, and IFN- induced upregulation of MHC molecules on B16-F10 MHC molecules. The data suggest that CD4+ T cell-derived IFN- exerts direct anti-proliferative effects on B16-F10 tumor cells in addition to facilitating lytic interactions of other effectors with tumor targets. rnAlthough anti-tumoral activity in mice was achieved with a single mutation, to combine several mutations would be preferable to address tumor heterogeneity and prevent escape. It was demonstrated that vaccination with an RNA encoding five different mutated epitopes interconnected by non-immunogenic linkers (pentatope RNA) had strong anti-tumoral effects, independent of the epitope position. rnThis work demonstrates that non-synonymous point mutations are a relevant source for anticancer vaccine repertoire, whose strongest feature may be the combined induction of mutation specific T-cell responses.rn
DDC:	000 Allgemeines 000 Generalities
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3626
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-42223
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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