Authors:	Cibis, Katharina Gabriela
Title:	Isolierung von Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäure-bildenden Bakterien aus Biogasanlagen
Online publication date:	10-Dec-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	In der vorliegenden Arbeit wurden Essigsäure-, Propionsäure und Buttersäure-bildende Bakterien aus einer thermophilen und drei mesophilen Biogasanlagen sowie aus zwei Hochdruck-Biogas-Laborfermentern isoliert. Die Fermenter waren mit dem nachwachsenden Rohstoff Maissilage, teilweise mit Rinder- oder Schweinegülle und weiteren festen Inputstoffen gefüttert. Für die Isolierung von Säure-bildenden Bakterien wurde ein Mineralsalzmedium verwendet, welchem als Kohlenstoffquelle Na-DL-Laktat, Succinat, Ethanol, Glycerin, Glucose oder eine Aminosäuremischung (Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Methionin und Cystein) hinzugefügt wurde. Hierbei handelt es sich um Substrate, welche beim anaeroben Abbau während der Hydrolyse oder der primären Gärung entstehen können. Die erhaltenen Isolate waren in der Lage, aus diesen Substraten Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure zu bilden. Insgesamt wurden aus den beprobten Anlagen 49 Isolate gewonnen, welche zu den Phyla Firmicutes, Tenericutes oder Thermotogae gehörten. Mit Hilfe von 16S rDNA-Sequenzen konnten die meisten Isolate als Clostridium sporosphaeroides, Defluviitoga tunisiensis und Dendrosporobacter sp. identifiziert werden. Die Bildung von Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure wurde in Kulturen von Isolaten festgestellt, welche als folgende Arten identifiziert wurden: Bacillus thermoamylovorans, Clostridium aminovalericum, Clostridium cochlearium/Clostridium tetani, Clostridium sporosphaeroides, Dendrosporobacter sp., Proteiniborus sp., Selenomonas bovis und Tepidanaerobacter sp. Zwei Isolate, verwandt mit Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, konnten Buttersäure und Milchsäure bilden. In Kulturen von Defluviitoga tunisiensis wurde Essigsäurebildung festgestellt. Ein Vergleich der 16S rDNA-Sequenzen mit Datenbanken und die Ergebnisse der PCR-Amplifikationen mit Isolat-spezifischen Primerpaaren ergaben zusätzlich Hinweise, dass es sich bei einigen Isolaten um neue Arten handeln könnte (z. B. Stamm Tepidanaerobacter sp. AS34, Stamm Proteiniborus sp. ASG1.4, Stamm Dendrosporobacter sp. LG2.4, Stamm Desulfotomaculum sp. EG2.4, Stamm Gallicola sp. SG1.4B und Stamm Acholeplasma sp. ASSH51). Durch die Entwicklung Isolat-spezifischer Primerpaare, abgeleitet von 16S rDNA-Sequenzen der Isolate oder Referenzstämmen, konnten die Isolate in Biogasanlagen detektiert und mittels qPCR quantifiziert werden (hauptsächlich im Bereich zwischen 1000 bis 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Weiterhin konnten die Isolate mit Hilfe physiologischer Versuche charakterisiert und deren Rolle in der anaeroben Abbaukette diskutiert werden. Die Art Defluviitoga tunisiensis scheint eine große Bedeutung in Biogasanlagen zu spielen. Defluviitoga tunisiensis wurde am häufigsten in Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit isoliert und konnte auch mit Hilfe des entwickelten Primerpaares in hohen Abundanzen in den beprobten Biogasanlagen detektiert werden (10000 - 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Die manuelle Annotation des Gesamtgenoms sowie die Substratverwertungsversuche haben gezeigt, dass Defluviitoga tunisiensis ein sehr breites Substratspektrum in der Verwertung von Kohlenhydraten besitzt und dadurch möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Verwertung von Biomasse in Biogasanlagen einnimmt. Mit Hilfe der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten somit neue Einblicke in die zweite Stufe des anaeroben Abbaus, die Acidogenese, in Biogasanlagen gegeben werden. \r\n In the present work, acetic, propionic and butyric acid forming bacteria were isolated from a thermophilic and three mesophilic biogas plants as well as two pressurized laboratory biogas fermenters. The fermenters were fed with maize silage and partially with cattle or swine manure and additional solid ingredients. A minimal medium supplemented with one of the following carbon source was used for isolation of acid-forming bacteria: Na-DL-lactate, succinate, ethanol, glycerol, glucose or a mixture of amino acids (alanine, serine, threonine, glutamic acid, methionine and cysteine). These substrates are formed during hydrolysis or primary fermentation during anaerobic digestion. The obtained isolates were capable to form acetic, propionic or butyric acid by conversion of these substrates. In total, 49 strains were isolated, which belonged to the phyla Firmicutes, Tenericutes or Thermotogae. According to 16S rRNA gene sequences analyses, most isolates were affiliated to Clostridium sporosphaeroides, Defluviitoga tunisiensis and Dendrosporobacter sp. Production of acetic, propionic or butyric acid were observed in cultures of isolates related to Bacillus thermoamylovorans, Clostridium aminovalericum, Clostridium cochlearium/Clostridium tetani, Clostridium sporosphaeroides, Dendrosporobacter sp., Proteiniborus sp., Selenomonas bovis and Tepidanaerobacter sp. Two isolates related to Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum formed butyric and lactic acid. In cultures of Defluviitoga tunisiensis, production of acetic acid was measured. Furthermore, comparison of 16S rDNA sequences with databases and the results of PCR amplificates with isolate-specific primer sets suggested, that several isolates could be new species (e.g. strain Tepidanaerobacter sp. AS34, strain Proteiniborus sp. ASG1.4, strain Dendrosporobacter sp. LG2.4, strain Desulfotomaculum sp. EG2.4, strain Gallicola sp. SG1.4B and strain Acholeplasma sp. ASSH51). By application of designed isolate-specific primer sets, derived from 16S rDNA sequences of isolates or reference strains, isolates could be detected in biogas plants and quantified by using qPCR (mainly in the range between 1000 and 100000000 copies of 16S rDNA per g BGP sample). Furthermore, isolates were physiologically characterized and their role during anaerobic digestion discussed. Defluviitoga tunisiensis seemed to be important in biogas plants. In present work, it was isolated most often and was detected in high abundances in biogas plants sampled using specific primer sets (10000 to 100000000 copies of 16S rDNA per g BGP sample). The substrate utilisation and the annotation of the whole genome of strain Defluviitoga tunisiensis L3 exhibited the capability of using a broad substrate spectrum of carbohydrates. Possibly, this is a reason for its proposed significant role of Defluviitoga tunisiensis during conversion of biomass in biogas plants.The obtained data of the present study provide novel insights into acidogenesis and microbial degradation of biomass in biogas plants.\r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3623
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-42184
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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