Authors:	Wolf, Marcus
Title:	Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine
Online publication date:	4-Dec-2015
Year of first publication:	2015
Language:	german
Abstract:	Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen. The microtubule network is an important structure for cell division and differentiation. Especially in plant cells with their specific arrays, many questions related to the organization and regulation, particularly the involvement of γ-tubulin, are still unanswered. Aim of the present study was to enable the in vivo detection of the cytoskeletal structures by fluorescence microscopy. To this end, transgenic BY-2 cell lines were established, stably expressing different cytoskeletal elements labeled with fluorescent proteins (FPs). rnAs basis for the experiments, a reliable method for Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of BY 2 cells was developed. For the expression of FP labeled cytoskeletal proteins, fusion constructs were cloned and transferred into BY-2 cells. Transgenic cell lines were obtained, stably expressing GFP labeled α- or γ-tubulin. They should provide a basis for future, more detailed investigations into the dynamics and regulation of the microtubule network. The fusion constructs in both cell lines were regulated by a double 35S promoter, leading to a strong and constitutive transgene expression. Detection of microtubule structures by fluorescence microscopy was possible. Last but not least, strong background fluorescence, resulting from the strong constitutive expression, impeded the documentation of fine arrays typical of the cytoskeleton. Therefore, attempts were made to reduce the expression levels appropriately. rnA physiological expression should e.g. be achieved by using the endogenous γ-tubulin promotor. Since the promotor was unknown at that time, its sequence was elucidated by DNA sequencing. This sequence was then inserted upstream of a corresponding fusion construct. Much lower expression levels in the resulting BY-2 cell lines were shown by fluorescence microscopy, requiring much longer exposure times. As a consequence, documentation was hampered by an interfering latent plant-specific autofluorescence of the cells. Although a more detailed documentation of fine cytoskeletal structures was not possible at this stage, the above-mentioned cell line should be suitable for further investigations, e.g. in experiments on expression patterns of γ-tubulin. Then, however, the application of a more sophisticated, highly sensitive microscope system is mandatory. First steps, i.e. application of deconvolution microscopy, were undertaken. rnFor colocalization studies of γ-tubulin and microtubules, a cell line was required expressing both elements labeled with different FPs. For this purpose the use of RFP-labeled tubulin was tested. A clear overexpression of solely RFP was possible. Yet, the expression of RFP-labeled α-tubulin was not detectable by fluorescence microscopy. Transfer and Integration of the fusion construct into the genome of the cells could be confirmed at the molecular level, but not its transcription, indicating gene silencing effects. Originally, the RFP (TagRFP) and GFP sequences used came from different organisms, a sea anemone and a jellyfish, respectively. Most likely, the straightforward replacement of TagRFP with a jellyfish GFP derivative, showing a fluorescence spectrum different from that of GFP, could solve the problem, thus permitting simultaneous expression and detection of labeled α- and γ-tubulin in the same cell.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3617
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-42105
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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